《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》：Biomimetic
de novo construction of hierarchically aligned and gradient-mineralized collagen for tendon-bone integrated regeneration
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为了解决肌腱-骨交界处天然组织复杂多尺度结构和成分梯度难以复制、传统移植物整合不良导致修复失败率高的问题，本研究报道了一种 de novo仿生构建策略，通过协同电组装和后处理，de novo构建了兼具层级胶原有序排列和梯度矿物质分布的胶原-矿物质仿生基质。该基质模仿了从肌腱到骨的天然细胞外基质结构，在兔模型实验中证实了其能够促进肩袖部位从肌腱到骨的多组织再生，显著改善功能恢复，为软组织-硬组织一体化再生提供了一个有前景的平台。
每年，全球有超过17亿的肌肉骨骼损伤发生，其中约一半涉及肌腱。肌腱是富含胶原的结缔组织，以其卓越的抗拉强度和刚度将肌肉力量传递至骨骼。重建稳定的肌腱-骨连接对于恢复关节功能至关重要，尤其是在旋转轴套修复等手术中。然而，当前的修复面临巨大挑战：常用的自体移植物和同种异体移植物存在供体部位并发症、免疫排斥和因老化导致的力学性能下降等限制；而人工合成的肌腱替代物虽然机械性能较好，但生物活性不足，导致组织整合不良。最棘手的问题是，肌腱-骨愈合处常常形成结构紊乱的瘢痕组织，缺乏天然肌腱-骨附着点所具有的有序胶原结构和矿物质梯度，这导致修复部位的机械强度比天然组织低一个数量级，术后再撕裂率高得惊人，甚至可达94%。如何复制天然组织从肌腱（软的、富有弹性的胶原组织）到骨（硬的、矿化的组织）之间平滑过渡的复杂结构和成分，实现真正的、功能性的“一体化”再生，是组织工程领域亟待攻克的难题。
为了回答这个难题，来自华东理工大学材料科学与工程学院的研究团队在《Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre》上发表了一项创新性研究，他们受自然界肌腱-骨连接处（称为“附着点”）精巧设计的启发，开发了一种“自下而上”的仿生构建策略，成功地 de novo制造出了具有层级有序胶原结构和空间梯度矿物质分布的仿生胶原-矿物质基质，并在兔模型中验证了其促进肌腱-骨一体化再生和功能恢复的卓越潜力。
研究团队运用了几项关键技术来构建和验证其仿生支架。首先，他们采用电组装技术，在低电压下驱动胶原分子在电极表面自组装成纳米原纤维网络。其次，通过机械拉伸结合离子溶液处理，引导这些纳米原纤维进一步组装，形成具有周期性D带特征、从纳米到微米尺度的层级有序排列的胶原纤维（称为HA-Col）。最后，利用扩散控制的聚合物诱导液体前驱体（PILP）矿化方法，在HA-Col的一端引入了从高到低连续变化的羟基磷灰石（HAp）矿化梯度，从而构建出梯度矿化的胶原支架（称为HAGM-Col）。在细胞和动物实验中，研究人员使用了兔的肌腱干细胞/祖细胞（TSPCs） 和骨髓间充质干细胞（BMSCs） 来评估支架的生物活性，并建立了兔肩袖肌腱-骨缺损模型，通过组织学染色、Micro-CT成像、生物力学测试和步态分析等手段，系统评估了支架在体内的再生效果。
5.1. 协同电组装和后处理引导具有强力学性能的层级胶原有序排列
研究人员首先从胶原分子出发，通过施加电场使其向阳极迁移并自组装成水凝胶。随后，在含有磷酸盐的离子溶液中，对水凝胶施加持续的机械拉伸，引导胶原纳米原纤维进一步组装、增粗，并形成类似天然肌腱的特征性D周期（约64.6纳米）结构，最终通过交联固定，得到了层级有序的胶原基质（HA-Col）。通过偏振光显微镜、扫描电镜和小角X射线散射等手段证实，施加的拉伸应变（50%， 100%， 150%， 200%）能显著提高胶原纤维的排列有序度。力学测试表明，在200%应变下制备的HA-Col在干燥状态下表现出高达约96 MPa的拉伸强度和约5.06 GPa的杨氏模量，这与天然肌腱的力学性能范围相当。
5.2. 对HA-Col进行仿生矿化进一步提升层级有序胶原的力学性能
为了模拟骨的矿化成分，研究团队采用优化的矿化前驱体溶液对HA-Col进行仿生矿化处理，得到均匀矿化的胶原基质（HAM-Col）。表征显示，矿化后材料表面沉积了羟基磷灰石（HAp）矿物质，同时长程胶原排列结构得以保留。矿化显著改变了材料表面性质，使其亲水性提高，表面模量增加。更重要的是，矿化大幅提升了材料的整体力学性能，HAM-Col的拉伸强度、杨氏模量和韧性均显著高于未矿化的HA-Col，其杨氏模量（约7 GPa）已接近人松质骨的范围，增强了与骨组织的力学相容性。
5.3. 梯度仿生矿化诱导HA-Col产生空间变化的物理化学性质
为了模仿天然肌腱-骨连接处的矿物质梯度，研究人员设计了一种扩散控制的矿化方法。将HA-Col垂直浸入容器，并通过注射泵缓慢注入矿化溶液，使溶液液面缓慢上升。这样，材料底部浸泡时间最长，顶部最短，从而在材料长度方向上形成了一个连续的矿物质含量梯度，得到梯度矿化胶原（HAGM-Col）。茜素红S染色、扫描电镜、能谱分析和原子力显微镜等结果一致证实，HAGM-Col从底部（高矿化区，Region I）到顶部（非矿化区，Region III）存在连续的钙/磷含量梯度、表面模量梯度（从约15 GPa降至约7 GPa）和亲水性梯度。
5.4. HAGM-Col引导区域特异性的肌腱生成、软骨生成和骨生成细胞表型
体外细胞实验验证了不同区域对细胞行为的特异性引导作用。在非矿化的有序排列区域（Area III），兔肌腱干细胞/祖细胞（TSPCs）能敏锐地感知胶原纤维的排列方向，黏附后迅速变为高度伸长、沿纤维方向排列的纺锤形。与生长在随机排列胶原（RF-Col）上的细胞相比，这些细胞表达了显著上调的肌腱相关基因（如Col1a1, Scx, Tnmd）。在矿化梯度区域，兔骨髓间充质干细胞（BMSCs）的表现则呈现出梯度依赖性：在低矿化区域（Area II-b），细胞在成软骨诱导培养基中表现出最强的糖胺聚糖（GAG）沉积和软骨相关基因（Sox9, Aggrecan）表达；而在高矿化区域（Area I），细胞在成骨诱导培养基中表现出最强的碱性磷酸酶（ALP）活性和骨相关基因（Ocn, Runx2）表达。这表明HAGM-Col能通过其梯度变化的物理化学性质，空间特异性地引导BMSCs向软骨细胞或成骨细胞分化。
5.5. 动物实验证实HAGM-Col促进兔模型的肌腱-骨一体化再生和功能恢复
在兔肩袖肌腱-骨缺损模型中，植入HAGM-Col支架的实验组在术后12周表现出最佳的修复效果。组织学分析显示，修复组织形成了从排列有序的肌腱样组织，到纤维软骨过渡带，再到新生骨组织的连续结构，更接近天然附着点的组织学形态。免疫组化显示I型胶原表达增加，III型胶原表达减少，表明再生组织的成熟度更高。Micro-CT分析表明，HAGM-Col植入组在骨结合部位的骨矿物质密度、骨体积分数等参数显著优于其他对照组。生物力学测试证实，HAGM-Col组的极限失效载荷和刚度恢复最好。术后12周的步态分析也表明，植入HAGM-Col的兔子其运动功能恢复最接近健康状态。
综上所述，这项研究成功地发展了一种创新的、自下而上的仿生构建策略。该策略通过电组装、机械拉伸和梯度矿化的协同作用，de novo制造出了能够模拟天然肌腱-骨连接处关键结构（层级有序胶原排列）和成分（矿物质梯度）的胶原基支架。这个“一体化”支架不仅具有与目标组织相匹配的优异力学性能和梯度变化的表面性质，更重要的是，它能为不同的干细胞提供空间特异性的微环境线索，分别引导其向肌腱细胞、软骨细胞和成骨细胞分化，从而在体内协调促进多组织的同步再生。在兔肩袖损伤模型中的成功验证，强有力地证明了这种仿生基质在促进功能性肌腱-骨一体化再生方面的巨大治疗潜力。这项工作不仅为修复复杂的软组织-硬组织界面提供了新的工程化解决方案，其“自下而上”构建多尺度有序结构的策略，也为其他需要复杂梯度组织的再生医学领域提供了重要的方法论参考。
