《Microbiology Spectrum》：Grass supplementation to a pellet-based diet fails to enrich gut microbiomes with wild-like functions in captive-bred hares
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本文探讨了肠道微生物组在圈养动物野化放归适应性的关键作用。研究通过对45只野生与圈养欧洲野兔（Lepus europaeus）进行宏基因组（Metagenomics）分析，发现两者肠道菌群在分类学与功能上（如氨基酸/糖降解能力）存在显著差异。研究通过“基因组解析宏基因组学”（genome-resolved metagenomics）技术，重建了860个宏基因组组装基因组（MAGs），其中87%为新物种。尽管补充新鲜牧草是放归前的常见饮食干预，但研究发现此举仅引起微小变化，未能使圈养兔肠道微生物组功能向野生型发生显著转变。这提示，基于特定食性偏好、而非仅是粗放型牧草补充的精准饮食干预，对于预适应动物肠道菌群、提高放归成功率可能更为有效。
引言
在持续的生物多样性危机中，圈养繁殖与放归计划已成为全球保护工作的重要组成部分。然而，许多放归计划的成功率有限，其原因往往不明晰。一个新兴的假设是，不适应的肠道微生物群可能在适应挑战中扮演重要角色。本研究以欧洲野兔（Lepus europaeus）为模型系统，通过基因组解析宏基因组学分析野生与圈养动物肠道微生物组的功能差异。我们利用一个正在进行的、在放归前会为动物进行饮食过渡（从纯颗粒饲料转向补充牧草的混合饲料）的圈养繁殖与放归计划，探究补充牧草能否使圈养野兔的微生物群落功能更接近其野生同类，从而促进其微生物组更好地适应消化自然食物。
材料与方法
本研究在吉普斯夸（巴斯克地区）地区政府管理的圈养繁殖计划框架内进行。该计划涉及一个精心管理的放归过程，圈养繁殖的野兔在放归前10天开始，在原有的颗粒饲料（每只动物140克）基础上，每2天补充200克干草甸草。研究收集了45份粪便样本，包括12只圈养兔在补充牧草前、12只在补充牧草10天后，以及21只野生兔的样本。野生样本来自猎人捕获的个体，直接从远端结肠/直肠采集肠道内容物。
样品处理遵循地球全基因组计划的数据生成流程。通过化学消化和机械裂解释放DNA，随后纯化并构建测序文库，在Illumina NovaSeq X平台上进行测序。数据处理采用标准流程，包括质量过滤、宿主基因组分离、宏基因组组装、分箱、质量评估和去冗余。最终得到860个宏基因组组装基因组（MAGs），并对其进行分类学（GTDB）和功能（Pfam, KEGG, CAZY等）注释，通过基因组推断功能性状（GIFTs）量化功能。统计分析在R中进行，包括α/β多样性分析、差异丰度分析等功能比较。
结果
欧洲野兔的基因组目录
研究共获得860个高质量宏基因组组装基因组，平均完整度为80.99%，污染率为2.21%。该目录以厚壁菌门A纲（61%）为主，其次为拟杆菌门。值得注意的是，749个MAGs（87.09%）缺乏物种水平注释，表明大部分微生物为新物种。MAGs在功能属性上表现出广泛多样性，系统发育相近的MAGs功能也更为相似。
野生与圈养野兔的分类和功能组成比较
野兔肠道菌群由14个细菌门组成，其中厚壁菌门A纲和拟杆菌门最为丰富。尽管两者共享相同的门，但其相对丰度存在显著差异。最显著的差异是螺旋体门在野生兔中含量丰富（11.73% ± 14.79%），而在圈养兔中几乎不存在（0.00063% ± 0.0007%）。此外，古菌Methanobacteriota仅在圈养个体中检测到。差异丰度分析确定了342个MAGs和30个属在两组之间存在显著差异。α多样性分析显示，圈养兔的丰富度和中性多样性更高，β多样性也显著不同。
功能分析显示，野生和圈养兔的肠道菌群功能容量存在差异。功能α多样性存在显著差异。共有29个功能在两组中富集。其中，圈养兔的微生物在降解四种抗生素、一种氨基酸、一种氮化合物和两种糖的途径，以及合成两种有机阴离子、两种氨基酸和一种抗生素（绿脓菌素）方面能力更强。相反，野生兔的肠道细菌在降解氨基酸、四种外源性物质、三种醇类、两种抗生素、氮化合物、D-木糖，以及合成氨基酸衍生物亚精胺和铁载体气杆菌素方面能力更强。
饮食转变为牧草对圈养兔微生物组的影响
研究发现，在圈养兔饮食中加入牧草并未导致微生物组成和功能的显著变化。α和β多样性在补充牧草前后无显著差异。差异丰度分析仅鉴定出11个MAGs存在差异。在功能上，仅有两个性状显示出显著变化：补充牧草后，能够合成铁载体葡萄球菌素的细菌丰度下降，降解抗生素氯霉素的能力也下降。总体而言，为期10天的饮食干预未能使圈养兔的微生物群落向野生型发生显著转变，无法实现有效的预适应。
讨论
欧洲野兔的多样化微生物组
研究重建的860个高质量基因组涵盖了14个细菌门和1个古菌门，其中87%的基因组代表了新物种，这反映了野生动物是巨大且大部分未知的微生物多样性的储存库。与依赖16S rRNA基因测序的研究一致，野兔肠道菌群高度富集厚壁菌门A纲和拟杆菌门，它们以降解植物纤维中的复杂多糖和产生短链脂肪酸而闻名。
圈养与野生野兔之间的差异
研究揭示了圈养与野生欧洲野兔肠道微生物组在分类学组成和功能能力上的显著差异。圈养环境下出现了7个独特的细菌物种和一个古菌物种Methanosphaera cuniculi，而后者在野生兔中不存在。最值得注意的分类学差异是螺旋体门的几乎完全缺失，该门是野生兔肠道菌群的第三大优势门。该门中鉴定的两个MAGs具有较强的降解α-/β-半乳聚糖和阿拉伯聚糖的能力，这可能有助于野生兔消化富含纤维的植物细胞壁。
在功能上，野生兔的微生物组在降解D-木糖（半纤维素的主要成分）和氨基酸方面能力更强，这可能反映了其对秋冬季节富含蛋白质的植物的适应。而圈养兔的微生物组在降解L-鼠李糖和L-岩藻糖（软性植物中含量丰富）以及氨基酸合成方面能力更强，这可能是对圈养中受控制、低蛋白饮食的补偿。此外，野生兔的微生物组降解外源性物质的能力也更强，这可能有助于其应对自然环境中的污染物。
饮食转变为牧草对圈养兔的影响
将圈养兔的饮食从颗粒饲料转变为补充牧草，仅引起了微生物组的最小变化。尽管在添加牧草后，与植物叶际相关的Luteimonas属丰度有所增加，但与小鼠研究中高谷物纤维饮食相关的Eggerthellaceae科丰度下降，但整体上并未引入新的细菌物种或显著增强功能能力。关键的螺旋体门并未因补充牧草而出现。10天的干预未能使圈养兔的微生物群落向野生型转变。这种有限反应可能归因于干预时间过短，或者表明需要更针对性的饮食策略。
结论
本研究证明了超越16S rRNA测序，整合基因组解析宏基因组学与功能性微生物组分析的价值。研究发现，在圈养饮食中添加牧草不足以使圈养兔和野生兔的微生物组对齐。观察到的功能差异表明，成功的动物预适应策略需要更细致地了解物种特定的食性，而非依赖粗放式的饮食调整。未来的多组学分析将有助于阐明微生物功能能力如何表达和调控。同时，纵向研究将有助于理解动物在自然条件下需要多长时间来重新配置其肠道微生物组，从而为设计有效的、支持放归前微生物组预适应的饮食干预措施提供信息，这对于物种再野化和保护工作的成功至关重要。
