《mSphere》：Differential assembly and functional roles of bacterial communities in coniferous and mixed conifer-broadleaf forest soils
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本研究通过整合16S rRNA基因扩增子测序与宏基因组鸟枪法测序，系统比较了针叶林与针阔混交林土壤细菌群落的组成结构、构建机制、共现网络和功能潜力，揭示了丰富与稀有类群在森林土壤生态系统中的互补性角色，强调了维持混合林对微生物功能多样性和森林健康管理的重要性。该工作为理解森林类型如何塑造微生物过程提供了新见解。
引言
森林生态系统是全球生物多样性和生态功能的核心，在碳储存、气候调节、水土保持和生物多样性保护中发挥着关键作用。土壤细菌群落作为这些生态系统的重要组成部分，驱动着碳、氮、磷等元素的生物地球化学循环，并支撑着有机质分解、养分循环、土壤结构形成和肥力调节等关键生态过程。因此，了解土壤细菌群落的结构和功能对于维护森林生态系统的可持续性至关重要。
针叶林和针阔混交林是北半球温带和寒温带地区两种主要的森林类型。虽然针叶林具有较高的碳储存能力和木材生产价值，但其相对较低的生物多样性以及对病虫害和环境干扰的有限抵御能力，制约了其整体的生态服务功能。在这些系统中引入阔叶树种形成了针阔混交林，通过支持更复杂的生态过程（包括水土保持和土壤保护），增强了生态系统的多样性和稳定性。然而，混交林也在管理和培育方面带来了额外的挑战。虽然先前的研究已考察了这些森林类型内部的微生物特征，但纯针叶林与混交林之间不同的生态背景，为探索土壤微生物群落组装的差异——特别是丰富和稀有细菌类群的功能作用和相互作用——提供了一个理想的框架。对这些生态系统中土壤细菌群落结构和功能的比较研究，将有助于阐明森林类型如何塑造微生物过程，并为森林管理和保护策略提供依据。
材料与方法
研究区域：
研究在中国东南部福建省的屏南古峰国有林场进行。实验样地位于北向坡，海拔965至1005米。该地区属于亚热带季风山地气候，无霜期约230天，年日照时长1501.5小时，年平均降水量2034.9毫米，分布在226天内。年平均气温在14.6°C至19°C之间，仲夏平均气温24°C，记录的极端气温在-6.4°C至32.2°C之间。优势土壤类型为中性喀斯特黄红壤。
研究针对两个31年林龄的林分：一个是以马尾松和杉木为主的针叶林；另一个是由杉木、马尾松和甜槠组成的针阔混交林。在混交林中，树种组成比例为4:15:6，林分密度为每公顷2501株，郁闭度0.75，林分蓄积量476.268 m3 ha-1。针叶林的马尾松与杉木比例为1:10，林分密度为每公顷3301株，郁闭度0.65，林分蓄积量467.553 m3 ha-1。
实验设计与土壤性质分析：
每种森林类型设置三个重复的10 × 10 m样地，样地间最小距离为50米以减少空间自相关性。在每个样地的0-20 cm深度采集复合土壤样品，一部分立即保存于-80°C用于微生物DNA提取，另一部分风干用于理化分析。测定的土壤理化性质包括土壤容重(SBD)、土壤有机质(SOM)、pH、速效钾(AK)、全钾(TK)、速效磷(AP)、全磷(TP)和碱解氮(AN)。
DNA提取、基因扩增与测序：
使用E.Z.N.A. Soil DNA Kit提取土壤总基因组DNA。用引物338F和806R扩增细菌16S rRNA基因的V3-V4高变区。在Illumina NovaSeq 6000平台上进行高通量测序。原始序列经质控、拼接、去嵌合体后，以97%相似性聚类为操作分类单元(OTU)。根据Jiao等人修改的框架，将相对丰度≥0.1%的OTU归类为“丰富”类群，相对丰度≤0.01%的归类为“稀有”类群。
宏基因组测序与生物信息学分析：
对6个土壤样本（每种森林类型3个）进行宏基因组测序。使用FASTP预处理原始读数，MEGAHIT从头组装，预测开放阅读框(ORF)并构建非冗余基因目录。通过比对KEGG数据库进行功能注释，并通过差异丰度分析识别生态学显著的功能特征。
统计分析：
使用R软件进行所有统计分析。α多样性通过Shannon指数评估。基于Bray-Curtis距离进行主坐标分析(PCoA)评估β多样性差异。使用Mantel检验评估环境距离矩阵与微生物Bray–Curtis相异性矩阵之间的相关性。进行冗余分析(RDA)以量化土壤性质解释的群落方差比例。基于Spearman相关性(P> 0.7，FDR调整后P< 0.05)构建细菌共现网络，并计算网络拓扑指数。应用基于零模型的iCAMP框架推断群落组装的生态过程，计算β最近分类单元指数(βNTI)和RCbray值，以区分确定性（同质化选择和异质化选择）与随机性（同质化扩散、扩散限制和漂变）过程。
结果
细菌群落结构：
从所有土壤样本中共获得1,584,307条高质量细菌序列，聚类为3079个OTU。丰富细菌OTU（176个类群）占微生物序列总数的71.10%，而稀有细菌OTU（2194个类群）仅占总序列的7.20%。比较分析显示，针叶林土壤中总细菌群落的Shannon多样性指数显著高于针阔混交林。然而，丰富和稀有亚群落的多样性无显著差异，表明森林类型影响整体细菌多样性，但不影响基于丰度的特定亚群多样性。基于Bray-Curtis距离的PCoA显示，两种森林类型之间的土壤细菌群落组成存在显著差异。稀有类群表现出更大的异质性。
火山图分析突出了不同森林类型间OTU的差异丰度。在总细菌群落中，361个OTUs显著上调，309个下调，主要存在于变形菌门(Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Acidobacteriota)。在丰富亚群中，仅11个OTUs上调，10个下调。而在稀有亚群落中，变化更为显著，223个OTUs上调，203个下调。在门水平上，变形菌门、绿弯菌门和酸杆菌门在两种森林类型的总群落和丰富群落中均占主导地位。稀有细菌群落则表现出更高的系统发育多样性。
土壤理化性质在森林类型间存在显著差异。针阔混交林的土壤pH和SOM显著高于针叶林，而AK则显著低于针叶林。Mantel检验显示，SOM与总群落和丰富群落均呈显著正相关。RDA分析表明，SOM对总群落和丰富群落的影响最强，尤其是在混交林中。AP显著影响总群落和稀有群落的结构，在针叶林中影响最明显。AK也被发现塑造了丰富群落的组成。
共现网络：
在总群落、丰富和稀有细菌群落的共现网络中观察到不同的拓扑特征。总细菌群落表现出较高的节点连通性和网络冗余，表明其功能稳定性较高。pH和SOM对这些拓扑属性具有正向调节作用。相比之下，丰富细菌群落展现出更精简的网络结构，节点主要位于外围和连接器区域，但仍保持较强的局部聚集性。AK对聚集性和信息传递产生负面影响，而SOM则支持其内部结构组织。稳健性分析表明，在节点移除后网络迅速瓦解，反映出其在扰动下的结构脆弱性。
稀有细菌群落表现出较低的连通性和信息传递效率。尽管AP和AK对网络扩展和连通性有正向贡献，但TK、SOM和pH对聚集性和传递效率的抑制作用超过了这些积极影响，表明其生态适应性有限，对环境波动更敏感。尽管丰度较低，但某些稀有类群占据了枢纽和连接器位置，暗示其潜在的关键功能角色。然而，稳健性分析证实了其对干扰的高度敏感性和功能冗余不足。
群落组装过程：
细菌群落的组装主要受随机过程支配。总群落和稀有群落的NTI值范围在-2到+2之间，表明在整体群落水平上没有强烈的系统发育聚集或过度分散。然而，丰富细菌群落的平均NTI显著高于总群落和稀有群落，表明存在弱的系统发育聚集，选择压力可能对高丰度类群产生影响。这一模式得到了βNTI分析的证实。总群落和稀有群落的大多数成对βNTI值落在±2范围内，与随机组装主导的情况一致。相比之下，丰富群落的βNTI分布左偏，值更低，表明其样本间系统发育相似性更高，具有更强的确定性选择特征。
基于βNTI和RCbray指标对组装过程的分解进一步支持了这些模式。对于总细菌群落，生态漂变解释了78.4%的β多样性变异，同质化扩散和异质化选择分别贡献了13.7%和6.5%。类似地，在稀有群落中，漂变仍然是主导过程（79.7%），而所有形式的选择过程加起来占比不到6%。与此形成鲜明对比的是，扩散限制解释了丰富群落71.9%的组装过程，漂变占剩余的28.1%。这些结果表明，高丰度类群主要受空间限制的结构性影响，并受到适度的环境过滤。
森林类型间功能通路的差异富集：
功能富集分析揭示了针阔混交林和针叶林土壤微生物群落之间不同的代谢特征。混交林中的群落显著富集了与糖基化、维生素生物合成和细胞修复相关的通路，表明其代谢活性升高，细胞维持和环境响应能力增强。相比之下，针叶林的微生物群落则富集了与自噬、细胞周期控制、细胞衰老、线粒体自噬、内吞作用、细胞骨架组织、MAPK信号、mTOR信号和鞘脂代谢相关的功能。这一功能特征表明其对胁迫响应和资源限制的适应能力增强。
碳、氮、磷、硫循环功能基因的差异丰度：
在森林类型间观察到生物地球化学循环遗传潜力的显著差异。针阔混交林土壤微生物群落中，编码普鲁兰酶、4-α-葡聚糖转移酶、细胞色素c过氧化物酶和寡聚-1,6-葡萄糖苷酶（这些酶参与多糖和淀粉降解、氧化应激反应和碳代谢）的基因丰度更高。这表明其在碳处理和能量获取方面的代谢活性增强。相比之下，针叶林土壤富集了编码过氧化氢酶-过氧化物酶、非血红素氯过氧化物酶和过氧化氢酶的基因，表明其氧化应激反应和解毒能力增强。
在中心碳代谢方面，混交林土壤显著富集了ppdk（丙酮酸磷酸二激酶），这是糖异生过程中将丙酮酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶。而针叶林微生物群落则富集了MCEE（参与氨基酸和脂肪酸代谢）、mdh（在TCA循环中催化苹果酸-草酰乙酸转化）和metF（支持叶酸介导的甲基化和DNA合成），表明其侧重于能量产生和生物合成途径。
氮循环潜力也明显不同：混交林土壤富集了nrfA（硝酸盐还原酶）和gdhA（谷氨酸脱氢酶），支持硝酸盐还原和氮同化。针叶林土壤则显示出更高的nirB（亚硝酸盐还原酶）和硝酸盐转运蛋白(NRT)基因丰度，表明其倾向于反硝化作用和硝酸盐吸收适应。
磷代谢基因如phoA（碱性磷酸酶）、HDDC3（水解酶）和phnH（磷酸酯酶）在混交林中更丰富，表明有机磷矿化作用增强。相反，针叶林群落富集了ppa（无机焦磷酸酶）和ppk1（多聚磷酸激酶），反映了其在节能的磷酸盐储存和胁迫响应方面的适应。
硫循环基因也表现出森林类型特异性：cysA（半胱氨酸转运蛋白）在混交林中富集，表明其高效的硫获取能力；而cysH（半胱氨酸合酶）在针叶林中更丰富，表明在半胱氨酸生物合成和支持抗氧化剂产生以应对胁迫方面的能力增强。
讨论
两种森林类型的细菌群落都表现出典型的长尾分布，少数高丰度类群在测序reads中占主导。尽管针叶林的总体多样性略高，但丰富和稀有亚群落之间的α多样性未检测到显著差异。稀有生物圈显示出显著更高的系统发育多样性，表明其进化起源更广泛，代谢潜能可能更广。两种森林间稀有类群存在显著的组成更替，大量OTU在混交林中表现出显著富集或减少，突显了其对环境变化的高度响应性。尽管相对丰度低，但稀有类群可能在多养分循环和维持生态系统功能中发挥着不成比例的重要作用。相比之下，丰富类群通常具有更广泛的代谢能力和更宽的生态位范围，使其能够在各种环境条件下繁衍生息。
冗余分析确定SOM和pH是塑造总群落和丰富细菌群落的主要驱动因素。相比之下，AP是影响稀有类群的主要因素，表明稀有物种占据更狭窄的营养生态位，对磷有效性表现出更高的敏感性。已确定的pH与网络复杂性之间的关系在此也很明显：混交林中较高的pH和SOM与更高的网络连通性和聚集性相关，表明碱性、富碳土壤促进了更复杂和潜在稳定的微生物网络。相反，pH和SOM的下降会导致网络碎片化，这可能破坏生态系统的恢复力。
共现网络分析进一步描绘了丰富和稀有类群的不同角色。总群落的网络表现出高连通性和模块性。然而，丰富的子网络更简单，节点和连接更少，这表明优势类群进行泛化的相互作用，形成了稳定的结构主干。尽管稀有类群网络显示出较低的边密度，表明其外围相互作用，但某些稀有OTU起到了关键枢纽的作用。这些稀有类群尽管丰度低，但在连接不同微生物群落、促进养分循环和维持整体网络稳定性方面扮演着关键角色。网络“小世界”架构的识别——少数高度连接的节点连接模块——突显了这些稀有关键物种的不成比例作用，并强调了网络可能因其丧失而变得脆弱。
群落组装机制分析揭示了随机过程在所有群落子集中的主导地位。生态漂变解释了总群落和稀有群落约80%的组成变异，而扩散限制解释了丰富类群约72%的变异。这一发现与山地森林中随机组装占主导的报道一致，但与报告稀有类群受确定性控制的研究形成对比。这种差异可能源于空间尺度、环境异质性和分类学分辨率的不同。在本系统中，稀有类群的小种群规模可能加剧了其对生态漂变的脆弱性，而扩散限制可能塑造了丰富类群在异质微生境中的分布。混交林中更高的植物多样性和根系分泌物异质性可能加剧了生态位分化和扩散限制，而单一的针叶林环境可能放大了漂变的作用。这种相互作用要求在推断组装规则时，需要分别考虑丰度类别。
在混交林中观察到的增强的碳和氮代谢途径，与实验证明相一致，即活性碳分泌物刺激氮周转并激活先前休眠或稀有的微生物类群。相反，针叶林中胁迫相关和免疫通路的富集表明，群落以适应酸性、贫营养土壤挑战的类群为主。稀有类群对速效磷(AP)和速效钾(AK)的特定敏感性，强化了这样一个概念：尽管这些生物在多养分循环中扮演着关键角色，但它们占据着狭窄的营养生态位。宏基因组研究进一步支持了这一点，表明稀有细菌多样性是比丰富类群多样性更强的碳分解速率预测因子。稀有类群在我们的共现网络中的拓扑重要性——例如它们作为关键枢纽的角色——与碱性湖泊沉积物中的发现相类似，在那里稀有微生物形成了一个持久的基因库并维持了网络的完整性。此外，随机过程对群落组装的压倒性影响与山地森林生态系统的工作相呼应。与报告稀有组合受确定性控制的研究的分歧，突显了这些生态规则的深刻背景依赖性，这些规则可能受空间尺度和环境异质性的支配。
功能分析揭示了两种森林类型之间根本的代谢差异，其基础是丰富和稀有类群之间的功能行会分离。在针阔混交林中，我们注意到编码碳水化合物活性酶和中心碳同化蛋白的基因显著富集。这些基因直接参与复杂碳水化合物的分解和同化，这对于森林生态系统中的土壤呼吸、有机质分解和碳循环至关重要。这些基因的存在表明，混交林中的稀有和丰富类群在促进初级生产和维持养分循环方面发挥着重要作用。相比之下，针叶林土壤富集了参与异养能量代谢的基因，这与优势类群在贫营养条件下的资源获取策略一致。最重要的是，混交林显著富集了用于特定生态位过程的专门遗传决定簇。这些包括nrfA（异化亚硝酸盐还原为铵）、phnH（有机膦酸酯降解）和phoA（碱性磷酸酶产生），这些基因在特定养分条件下促进关键的生物地球化学转化。稀有生物圈携带此类特殊基因，并具有相当大的遗传和功能冗余，使这些类群尽管丰度低，却能够在氮、磷和硫循环中执行关键步骤。这种功能能力，加上它们作为“种子库”快速响应变化的潜力，将稀有类群定位为生态系统恢复力的重要媒介。
这种功能专门化在针叶林中也很明显，cysH的富集（该基因对于将硫酸盐同化还原为半胱氨酸至关重要）表明其对硫胁迫的适应。这种通常由稀有细菌促成的生态位特异性途径，通过环境波动期间的功能冗余增强了群落的稳定性。总体而言，这些结果提供了基因组学证据，支持这样一个范式：丰富类群维持核心生态系统代谢，而稀有类群提供关键的、专门的催化功能。丰度类别之间的这种协同伙伴关系是维持不同森林生物群落间多养分循环的基本机制。
结论
本研究阐明了植物多样性和土壤化学在构建针叶林和针阔混交林土壤细菌群落中的相互依赖作用。通过整合高通量测序、宏基因组功能分析、共现网络分析以及群落组装的零模型分析，我们证明了森林类型是土壤环境条件的主要决定因素，土壤有机质(SOM)和pH是总群落和丰富群落结构的关键预测因子，也是网络复杂性和稳定性的促进因素。相比之下，速效磷(AP)和速效钾(AK)对不同丰度类别施加了更微妙但独特的选择压力。在功能上，混交林富集了碳和氮代谢途径，而针叶林则显示出增强的胁迫相关信号和免疫功能。随机过程，特别是生态漂变，在两种森林类型的群落组装中占主导地位，尽管扩散限制成为丰富类群的重要制约因素。展望未来，结合时间动态和多组学方法的研究，对于揭示植物-土壤-微生物相互作用的因果机制和预测生态系统对环境变化的响应至关重要。
