《Bioresource Technology》：Electrostatic-guided substrate flip enables complete di-ester bond hydrolysis of phthalate esters by a bacterial carboxylesterase and development for immobilized biocatalysis
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邻苯二甲酸酯酶PAEIII的催化机制及工程化改造研究表明，E188和H399通过静电作用引导中间体构象翻转，Y118通过氢键和π-π堆积稳定底物，使双酯键完全水解。成功将型I酶CarB152改造为CarB152-F118Y，并发现Est909酶活性提升116.8%。构建的藻酸盐固定化系统在10次循环中保持>90%降解率，水解效率达4.0 g/(L·d)。揭示了型III酶双酯水解的静电引导机制，为开发高效环境修复酶提供了理论依据和工程策略。
赖静辉|卢鸿云|魏春辉|吕传娟|张新月|戴梦琪|宗恩祥|黄明权|黄志国|徐有强|孙宝国
教育部老年营养与健康重点实验室（北京科技商务大学），中国北京100048
摘要
邻苯二甲酸酯（PAEs）作为主要的内分泌干扰物，由于其毒性对人类健康和环境构成严重威胁。酶促水解提供了一种有前景的解毒途径，但二酯键的酶促断裂不完全仍然是PAEs水解的瓶颈。这主要是由于对III型水解酶如何实现PAEs二酯键水解的机制理解有限。本研究通过整合分子对接、分子动力学模拟和定点突变技术，揭示了一种代表性III型水解酶PAEIIIase的新电静力引导机制。具体而言，残基E188和H399通过电静力相互作用介导单酯中间体的空间翻转，而Y118通过氢键和π–π堆叠稳定底物，从而促进PAEIIIase的连续酯键断裂。基于这一催化机制，同源的I型水解酶CarB152通过靶向工程改造成功转化为能够完全水解二酯键的III型水解酶CarB152-F118Y。此外，同源性筛选发现了一种更高效的酶Est909，其对二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯的水解活性比PAEIIIase高116.8%。为了提高实际应用性，构建了一种基于海藻酸钠的稳定化全细胞系统。该系统表现出优异的性能，在连续10个循环中底物降解率保持在90%以上，水解效率超过4.0克/升·天。总体而言，本研究显著推进了对完全二酯键断裂的酶促机制理解，为功能升级密切相关的水解酶提供了有前景的工程策略，扩展了PAEs降解的酶工具箱，并建立了一个技术上可行的生物催化平台，具有在可持续PAEs修复中的潜在应用价值。
引言
邻苯二甲酸酯（PAEs）是一类常见的增塑剂，通常以30%–45%（重量比）的比例添加到聚氯乙烯等塑料中，以增强其柔韧性和耐久性（Gao等人，2016年）。由于它们的非共价结合特性，PAEs在生产、使用和处置过程中容易释放，导致其在环境中广泛扩散（Net等人，2015年）。全球年产量超过600万吨，其中一半进入生态系统，在地下水、空气、土壤和污泥中普遍存在（Net等人，2015年）。由于在低浓度下去除不完全，污水处理厂（WWTPs）是PAEs污染的主要来源（Kanaujiya等人，2019年）。在农业系统中，长期灌溉和污泥施用会导致小麦、水稻和玉米等作物中PAEs的积累，从而增加饮食暴露风险（Dong等人，2019年）。
PAEs是公认的内分泌干扰物，与生殖毒性、神经发育障碍和肥胖有关（Xu等人，2020年）。值得注意的是，单酯代谢物也表现出显著的毒性。例如，单丁基邻苯二甲酸酯（MBP）会影响受精过程，而单甲基邻苯二甲酸酯（MMP）和单乙基邻苯二甲酸酯（MEP）会降低囊胚质量（Deng等人，2020年）。除了毒性外，PAEs还具有显著的环境持久性。在水生系统中，非生物水解和光解效率低下，二甲基邻苯二甲酸酯（DMP）的半衰期为3.2年，而二(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（DEHP）的半衰期长达2000年（Puri等人，2023年）。虽然微生物降解是土壤和沉积物中PAEs的主要去除途径，但其效果受基质影响显著（Sun等人，2022年）。有氧条件可促进降解，而厌氧沉积物则会导致疏水性PAEs（如DEHP）的长期积累（Puri等人，2023年）。这种持久性凸显了需要高效和可持续的修复策略。
尽管已经探索了物理吸附和化学降解方法来处理PAEs，但这些方法往往存在降解不完全和二次污染的问题（Xu等人，2021年）。吸附方法只是将污染物转移，存在后续释放的风险（Emmanuel等人，2022年）。化学方法虽然能够断裂苯环，但能耗高且可能产生有毒副产物。某些光化学衍生物（如-OH-邻苯二甲酸酯和-M-OH-邻苯二甲酸酯）的水生毒性或雌激素活性高于母体化合物（Gao等人，2015年），限制了这些方法的广泛应用。相比之下，微生物酶促水解具有更高的特异性，并且在温和条件下操作（Lai等人，2026年）。由于PAEs的毒性主要来源于酯键连接的侧链，针对这些键的水解酶特别值得关注（Xu等人，2021年）。这些水解酶分为I型（单酯水解）、II型（单酯水解）和III型（同时断裂二酯键）（Xu等人，2020年）。虽然结合I型和II型水解酶可以实现PAEs向毒性较低的邻苯二甲酸（PA）的完全水解（Huang等人，2019年），但这类多酶系统通常需要额外的纯化步骤和不匹配的反应条件（Lai等人，2023年）。相比之下，III型水解酶能够独立催化完全水解，简化了工艺流程，是PAEs解毒的有希望的候选方法（Xu等人，2022年；Lai等人，2023年）。
然而，高效的III型水解酶仍然稀缺，迄今为止仅报道了九种（表S1），且它们的催化性能受环境条件影响（Xu等人，2021年）。从机制上看，尽管提出了一个通用的酸碱催化模型，但邻苯二甲酸单酯（PMEs）的负电荷羧基团可能会产生电静力排斥，阻碍第二步水解（Sun和Syrén，2025年）。这引发了一些关键问题：III型水解酶如何克服这一障碍以实现完全二酯键断裂？它们与同样能结合PAEs但无法催化第二步的I型酶有何分子差异？完全二酯键水解的机制仍很大程度上未得到解决。
为了解决这些问题，本研究系统地研究了一种代表性的III型水解酶PAEIIIase。研究目标包括：（1）阐明其二酯键水解的分子催化机制；（2）识别具有高催化潜力的同源酶；（3）开发一种全细胞稳定化策略以提高操作稳定性和重复使用性。这些发现将加深对III型水解酶的机制理解和实际应用。
化学物质和介质
所使用的PAEs包括DMP（99%）、二乙基邻苯二甲酸酯（DEP，99%）、二丁基邻苯二甲酸酯（DBP，99%）、二异丁基邻苯二甲酸酯（DIBP，99%）和DEHP（99%），以及PMEs包括MMP（99%）、MBP（99%）和单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯（MEHP，99%），均由北京医药化学试剂有限公司购买。所有化合物均溶解在二甲基亚砜（10克/升）中。色谱级n-己烷和甲醇购自J&K Scientific。其他试剂为分析级。PAEIIIase的GenBank登录号为...
分子对接以识别PAEIIIase的关键催化残基
分子对接结果显示，酶-底物相互作用包括氢键、π–π堆叠、疏水接触和盐桥（图1A）。氢键主要形成于G105、G106、A107、Y118、S189和A190，表明它们在底物结合中的重要性。结合位点分析（5埃范围内）显示，PAEs和PMEs占据保守但部分不同的区域（图1B）。因此，这些残基被分为三组：U1（与PAEs相关）、U2...
结论
本研究建立了PAEs酶促二酯键水解的整合框架，弥合了基础分子机制与实际环境修复之间的差距。首先，我们阐明了III型PAEs水解酶PAEIIIase的催化机制，并确定了特定残基在电静力引导和底物稳定中的关键作用。这些发现为理解这些酶的高效作用提供了结构基础...
伦理要求遵守情况
本手稿不包含任何作者参与的人类或动物实验。
作者贡献声明
赖静辉：撰写——原始草稿、方法学、数据管理。卢鸿云：方法学。魏春辉：实验研究、数据分析。吕传娟：数据管理。张新月：数据管理。戴梦琪：数据管理。宗恩祥：数据管理。黄明权：撰写——审稿与编辑。黄志国：撰写——审稿与编辑。徐有强：撰写——审稿与编辑、方法学、实验研究、资金获取。孙宝国：撰写——审稿与编辑。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：32572513、32072165）的支持。
