无需校准的钾离子定量方法：基于激光诱导石墨烯上的化学计量酶级联反应

《Biosensors and Bioelectronics》：Calibration-Free Potassium Quantification via a Stoichiometric Enzyme Cascade on Laser-Induced Graphene

钾离子生物传感器通过激光诱导石墨烯电极和丙酮酸激酶/氧化酶级联反应实现无标定检测，线性范围2-8 mM，检测限1.56 mM，适用于点-of-care钾浓度快速监测。

　　

金彩允（Chaeeun Kim）| 金彩亨（Chaehyung Kim）| 金宇俊（Yujoon Kim）| 李康元（Kangwon Lee）

韩国首尔国立大学融合科学与技术研究生院应用生物工程系，首尔08826

摘要

钾离子（K⁺）的监测对于临床管理至关重要，尤其是在需要快速可靠分析的即时检测（POCT）中。传统的电位选择性离子电极依赖于平衡电位响应和频繁的校准，这限制了它们在分散式检测中的应用。本文介绍了一种基于丙酮酸激酶/氧化酶（PK/POx）酶级联反应的安培型钾离子生物传感器，该传感器与激光诱导石墨烯（LIG）电极相结合。钾离子依赖的酶活性通过4-硝基苯胺介导的氧化还原循环转化为直流信号。多孔且富含缺陷的LIG结构作为加速反应的电化学界面，促进了酶的转化和介质辅助的电子转移。在优化条件下，该传感器在2–8 mM的生理范围内表现出线性响应，检测限为1.56 mM，对干扰离子具有高选择性，传感器间的重复性优异（RSD = 2.41–5.20%），并在添加了钾离子的人血清样本中表现出可靠的性能。通过采用基于速率控制的电流模式传感方式，而非基于平衡的电位测量方法，PK/POx/LIG平台可以在使用时无需特定传感器校准或用户操作即可进行钾离子监测，从而实现POCT应用中的快速检测。

引言

钾离子（K⁺）是一种重要的电解质，支持多种生理功能，包括维持细胞内外离子平衡、肌肉收缩、神经信号传递和心脏节律调节（Zacchia, Abategiovanni等人，2016）。血液中的钾离子水平必须精确保持在正常范围内（3.5–5.0 mM），超出此范围可能导致严重的生理异常，如心律不齐、肌肉无力、神经传导障碍和危及生命的高钾血症（Viera和Wouk，2015）。慢性肾病（CKD）患者，尤其是接受透析的患者，由于肾功能受损，更容易出现钾离子浓度快速波动，因此及时监测钾离子浓度具有临床重要性（Alexander Sarnowski，2022）。这些临床挑战凸显了即时检测（POCT）平台的需求，这些平台能够快速准确地测量血液中的钾离子浓度（Park, Kim等人，2025）。

尽管已经探索了光学、荧光和比色传感方法用于生化分析（Kangwon Lee，2010；Changheon Kim，2021；Gyubok Lee，2022），但这些技术通常需要大型光学组件、精确对齐和多步骤试剂处理，这限制了它们在POCT中的适用性。相比之下，电化学生物传感器在即时检测应用中具有固有的优势，包括易于微型化和低制造成本（Wang，2006；Bambang Kuswandi，2025）。它们还能快速响应少量样本，并且可以使用简单的电子电路进行操作，适用于便携式设备和实际临床环境。各种电化学生物传感器设计采用了酶级联反应、氧化还原介质和电流模式转换机制，以提高灵敏度并实现无需校准的操作（Liu, Gao等人，2021）。

电化学离子传感器可分为电位型和安培型系统。尽管有多种转换策略，但大多数临床使用的钾离子传感器仍然依赖于电位选择性电极，这些电极根据离子活性生成电压信号（Gao, Emaminejad等人，2016；Hutter, Collings等人，2022）。尽管这些电压型传感器被广泛临床应用，但它们本质上容易受到信号漂移的影响，需要频繁校准和稳定处理以确保可靠运行。这些要求在POCT环境中构成了根本性限制，因为POCT环境需要快速、稳健的测量结果，并且用户干预最小（Marc Parrilla，2019）。

相比之下，安培型传感代表了一种根本不同的电流模式传感方式，其中分析信号由反应速率而非平衡电位决定。通过直接测量与反应动力学成比例的电流信号，安培型系统能够实现快速响应、高信噪比和简化的测量流程，无需长时间稳定处理。从转换角度来看，电流模式传感提供了一个由反应动力学决定的分析输出框架，而不是由平衡电位形成决定的输出。当与预定义和固定的检测条件结合使用时，这种框架可以直接从使用点的测量电流推断出钾离子浓度（Sassolas，2008；Georgiou，2021）。

当与基于酶的传感策略结合时，这种方法尤其有效，该策略将离子浓度变化转化为酶反应速率的变化，并将其作为电化学信号读取。在这种情况下，丙酮酸激酶（PK）对钾离子具有依赖性激活作用，因此PK/POx酶级联反应可以作为一种生化转换器，将钾离子浓度变化转化为可测量的电化学电流信号（Oria-Hernández等人，2005）。

电化学酶传感器的性能受到介质电子转移效率和电极界面物理化学性质的影响。高效的介质氧化还原循环需要具有高导电性、大表面积和丰富电化学活性位点的电极（Lee, Reginald等人，2025）。基于碳的电极天然满足这些要求，因此在生物传感器应用中被广泛采用。在现有的制造方法中，直接激光写入（DLW）通过局部热解将聚酰亚胺（PI）转化为激光诱导石墨烯（LIG），提供了一种无需掩模且可扩展的高性能碳电极制造方法（Jian Lin，2014；Movaghgharnezhad和Kang，2024）。最近的研究表明，LIG可以促进复杂的电催化和生化反应，包括硝酸盐还原和葡萄糖驱动的生物传感（Geng, Feng等人，2024；Gu, Zhang等人，2025），这凸显了其在分析和治疗应用中的多功能性。这些发现共同证明了DLW制造的LIG在生物传感平台中的潜力（Liu, Cheng等人，2022）。

LIG具有多孔三维结构、高缺陷密度、优异的导电性和大的电活性表面积，这些特性都非常有利于酶的固定和介质辅助的电子转移（Gao, He等人，2021；Mingyang Liu，2023）。此外，DLW可以实现用户定义的电极几何形状的无掩模和无化学处理的数字图案化，并且兼容卷对卷制造（Luong, Yang等人，2019）。这些特性使LIG成为高通量、低成本制造一次性生物传感器的理想平台（Ye, James等人，2019）。

据我们所知，本研究报道了首个通过化学计量控制的酶动力学转换机制将钾离子浓度变化直接转化为电流信号的安培型钾离子生物传感器。我们通过将PK/POx酶级联反应与LIG电极结合，建立了一个专为POCT设计的电流模式钾离子传感平台。通过电极制造、表面表征、酶固定、介质辅助的电子转移分析及其分析性能的全面评估，系统地证明了该平台的技术有效性。

试剂和材料

丙酮酸激酶（PK，EC 2.7.1.40）、丙酮酸氧化酶（POx，EC 1.2.3.3）、聚环氧乙烷（PEO）、腺苷5’-二磷酸钠盐（ADP-Na）、磷酸烯醇丙酮酸三环己基铵盐（PEP）、4-硝基苯胺（4-NA）、Triton X-100、三氯化铁、磷酸二氢锂、硫酸镁、甘油、Tris-HCl缓冲液（pH 7.0）、氯化钾（KCl）、人血清和Ag/AgCl糊剂（113-09）均从商业供应商处购买，并按原样使用。所有水溶液均

激光诱导石墨烯电极平台：制造和物理化学表征

评估了LIG电极的结构和电化学性质，以确认其作为生物传感器平台的适用性。场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）显示LIG表面具有高度多孔和起伏的微观结构（图2A，B），表明其具有较大的可访问表面积，有利于生物分子的装载。为了研究激光辐照策略对LIG均匀性的影响，分别进行了单步和双步

结论

在这项研究中，我们开发了一种安培型钾离子生物传感器，它通过基于丙酮酸激酶/氧化酶（PK/POx）级联反应与激光诱导石墨烯（LIG）电极结合的酶动力学转换机制，将细胞外钾离子浓度变化转化为电化学电流信号。通过利用PK的钾离子依赖性活性和4-硝基苯胺（4-NA）介导的氧化还原循环，该平台的工作原理与

CRediT作者贡献声明

金彩亨（Chaehyung Kim）：研究、数据分析。金宇俊（Yujoon Kim）：研究。李康元（Kangwon Lee）：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、概念构思。金彩允（Chaeeun Kim）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、可视化、验证、方法学设计、研究、数据分析、概念构思

未引用的参考文献

Alexander Sarnowski等人，2022；Bakker等人，1997；Bambang Kuswandi等人，2025；Changheon Kim和Lee，2021；Datta等人，2013；Francesca Criscuolo等人，2021；Gao等人，2021；Gao等人，2016；Geng等人，2024；Gu等人，2025；Gyubok Lee等人，2022；Hutter等人，2022；Jian Lin等人，2014；Jianfeng Ping等人，2011；Kangwon Lee和Kim，2010；Korolev等人，2025；Lee等人，2025；Liu等人，2022；Liu等人，2021；Luong等人，2019；Marc Parrilla和Crespo，2019；

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。