《Biosensors and Bioelectronics》：Minimalist Digital Microfluidics for High-Performance Multiplexed Protein POCT: A Wash-Free, Sample-to-Answer, and Trace-Sample Paradigm
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集成数字微流控平台iDMF-mLOCI通过电泳精确操控微滴，实现血浆快速分离（<30秒）、无需洗涤及高重复性（CVs<9.1%）。平台可同时检测IL-6（LOD 2.2 pg/mL）、PCT（0.05 ng/mL）和HBP（0.2 ng/mL），诊断脓毒症AUC达0.934，与实验室方法R2>0.94，显著提升急诊诊断效率。
作者：李卓如、张海波、郭庆生、王尧、毛恩强、赵冰、徐洪
上海交通大学生物医学工程学院，中国上海 200030
摘要
高性能蛋白质即时检测（POCT）已成为临床上的迫切需求，尤其是在急性病患情况下需要快速做出决策时。然而，目前的蛋白质POCT技术（如侧向流动分析和电化学传感器）难以同时实现高灵敏度、操作简便性和稳定性。在这项工作中，我们开发了一种基于数字微流控技术的多功能荧光氧通道免疫分析平台（iDMF-mLOCI），该平台利用精确的液滴操控技术在微流控芯片（DMF）上实现无需清洗的多重检测。该系统具有以下独特优势：（1）快速的芯片内血浆分离（< 30秒）；（2）无需清洗步骤（珠子保留率100%，处理速度比传统DMF免疫分析快23%）；（3）高重复性（变异系数（CV）< 9.1%）。这些技术进步使得仅需2.2微升微量样本即可灵敏地检测多种蛋白质生物标志物（检测限（LODs）：白细胞介素-6（IL-6）为2.2 pg/mL，降钙素原（PCT）为0.05 ng/mL，肝素结合蛋白（HBP）为0.2 ng/mL）。通过使用iDMF-mLOCI平台，我们评估了其在败血症诊断中的应用，结果显示其具有出色的诊断准确性（曲线下面积（AUC）= 0.934），并且与临床常用的中心实验室检测方法具有很强的相关性（决定系数（R2）> 0.94）。这项工作定义并展示了一种创新的样本到结果范式，将简便性、多重检测能力、灵敏度和精确性无缝结合，从而推动了重症监护领域高性能POCT诊断技术的发展。
引言
在重症监护环境中，迫切需要高性能的多重蛋白质定量检测，因为诊断和治疗的延迟会显著增加死亡率，这一点得到了世界卫生组织（WHO和世界银行，2023年）的强调。传统的中心实验室检测方法由于样本运输和单一分析的限制，无法满足急诊科、重症监护室（ICU）和院前场景对及时决策的需求（Arshavsky-Graham和Segal，2022年）。能够进行多重生物标志物检测的先进即时检测（POCT）技术具有革命性意义。对于急性心肌梗死（AMI），即时检测心肌肌钙蛋白I和T（cTnI和cTnT）可将诊断时间缩短30-50%（Collet等人，2021年）；对于败血症，由于抗生素治疗每延迟一小时死亡率会增加7-10%（Seymour等人，2017年），因此需要通过床边多重定量检测降钙素原（PCT）、白细胞介素-6（IL-6）和C反应蛋白（CRP）来快速区分并指导治疗。因此，开发能够进行灵敏多重蛋白质定量检测的高性能POCT平台对于改善时间敏感型紧急情况的结局至关重要。当前的高性能蛋白质POCT平台在分析能力、操作简便性和可靠性之间存在显著的权衡。侧向流动分析（LFAs）提供快速、低成本的检测，但由于纸质基底的固有异质性（Zhou等人，2021年），其灵敏度有限（通常为ng/mL至sub ng/mL），且重复性较差（变异系数（CV）>15%），即使通过荧光标记（Arai等人，2024年；Zhang等人，2025年）、酶催化信号放大（Li等人，2024年）或表面增强拉曼光谱（SERS）探针（Peng等人，2024年；Srivastav等人，2021年）进行改进，也难以实现可靠的定量。微流控芯片（例如压力驱动、离心设计）能够实现精确的纳升级液体处理和增强的定量能力（Lehnert和Gijs，2024年），但由于依赖外部泵、阀门和复杂的流体网络，系统的体积、成本和脆弱性增加，限制了其在实际POC应用中的实用性（Akhtar等人，2023年；Lim等人，2022年；Lyu等人，2021年）。电化学生物传感器具有优异的灵敏度（通常为pg/mL）并通过直接电子读数实现微型化（Shahdeo等人，2022年），但由于复杂生物样本中的串扰和表面稳定性问题，其稳定性和多重检测能力仍具有挑战性（Saxena等人，2024年；Sharafeldin和Rusling，2023年）。因此，虽然每种平台都有其独特优势，但将高灵敏度、多重检测能力、操作便捷性和稳定性整合到单一的POCT系统中以用于重症监护仍然是一个具有挑战性的目标。
数字微流控技术（DMF）为克服这些限制提供了先进的解决方案。DMF是一种芯片上的实验室技术，利用电润湿效应（EWOD）原理，可以在平面表面上对纳米至微升大小的液滴进行可编程的操控（传输、分割、分配、合并和混合）（Yang等人，2023年）。DMF由紧凑的集成电路组成，无需精密泵、阀门、固定通道或机械部件（Tong等人，2023年）。由于其精确的液滴控制、自动化、微型化和稳定性优势，DMF在POCT领域得到了广泛应用。尽管DMF在核酸POCT（如PCR和CRISPR工作流程（Bai等人，2025年；Xie等人，2025年）方面的开发更为广泛和商业化，但近年来其在蛋白质生物标志物检测中的应用也迅速增加（Sathishkumar等人，2025年；Zeng等人，2024年）。虽然DMF提高了检测灵敏度并降低了复杂性，但在单次测量循环中的多重检测能力仍有显著差距。为了实现单次免疫分析中的多分析物检测，Li等人（Li等人，2022年）在DMF芯片表面固定了多个捕获抗体条带，实现了亚ng/mL级别的10种促炎细胞因子的检测。尽管这种方法通过将不同分析物分配到不同的物理位置来区分多重目标，但由于需要固定捕获抗体，制造复杂性和成本有所增加。此外，固相固定限制了生物分子反应动力学，从而限制了整体检测灵敏度。另一种方法是Lee等人（Lee等人，2020年）使用磁珠作为目标捕获载体，并使用不同的荧光检测抗体作为标记，实现了两种细胞因子的同时检测。这种方法利用了磁珠的准液态环境来改善抗原-抗体结合动力学，从而提高了灵敏度。然而，用于检测抗体的荧光标记物的光谱差异有限，这限制了单次反应中的多重检测能力。此外，当前的DMF蛋白质免疫分析主要依赖于传统的荧光、化学发光或电化学方法，这些方法通常需要多步骤的清洗过程，这通常占总检测时间的15-40%（表S1）。因此，开发新型的多重蛋白质检测策略以规避这一清洗瓶颈对于实现高性能POCT至关重要。
在这里，我们开发了一种基于数字微流控技术的多功能荧光氧通道免疫分析平台（iDMF-mLOCI），这是一种无需清洗的多重蛋白质POCT平台，集成了三个功能模块（图1）：（I）芯片内原位血浆分离，（II）无需清洗的多重免疫分析反应，以及（III）芯片内信号读出。在模块（I）中，Vivid GR膜能够直接从指尖采血样本中快速提取血浆，实现了最小化的侵入性和真正的微量样本采集，这对于开发实用的样本到结果输出诊断系统至关重要。模块（II）实现了无需清洗的多重荧光氧通道免疫分析（mLOCI）。正如我们之前的研究（Guo等人，2020年）所报道的，mLOCI使用编码的宿主微珠（EHBs）作为多重分析物识别的条形码，结合在EHBs上的受体纳米珠（ABs）作为信号生成器。首先，样本液滴与含有多重EHB@ABs@Ab1珠子（Ab1指特定的捕获抗体）及其生物素化检测抗体（Ab2-biotin）的液滴混合，使目标抗原被Ab1捕获并在相应的EHB表面形成夹心免疫复合物。然后，含有EHB@ABs@免疫复合物的液滴与含有链霉亲和素包被的供体纳米珠（DB-SA）的液滴混合，从而用DBs标记它们，形成所需的“编码珠子–免疫复合物–DB”配置。在680纳米激发下，DBs产生的单线态氧（1O?）激活相邻的ABs，导致615纳米处的明亮荧光发射。重要的是，mLOCI机制严格依赖于距离：只有形成这种结构的珠子才能使DBs和ABs保持在必要的距离（< 200纳米）内，以实现有效的1O?扩散，确保只有含有有效免疫复合物的珠子产生信号，而未结合的组分则保持沉默。因此，整个工作流程仅涉及几个通过逻辑编程自动驱动的液滴混合步骤，无需去除多余的DBs和未反应的试剂，实现了真正无需清洗的“混合-测量”多重免疫分析。模块（III）具有亲水成像位点，确保微球在检测过程中不会移动，从而可以直接在芯片上进行光学成像，实现条形码和共定位LOCI信号的检测，从而实现多种生物标志物的同时定量。通过整合这三个模块，iDMF-mLOCI平台实现了简单、多重、灵敏和稳健的蛋白质分析。在这项工作中，我们系统地建立了iDMF-mLOCI系统的分析性能，并验证了其准确性。然后，我们应用这一成熟的平台对三种代表性的炎症生物标志物（IL-6、PCT和肝素结合蛋白（HBP）进行了准确定量，最后展示了其在败血症POC鉴别中的潜力。凭借其超简单的操作流程、快速分析和出色的稳健性，iDMF-mLOCI为改善重症监护领域的临床结果提供了有前景的下一代POCT工具。
材料
本研究使用的所有材料、试剂和抗体在补充方法（S1节）中有详细描述。
DMF平台和液滴操作
作为iDMF-mLOCI的核心硬件，构建了一个可编程的DMF平台。该芯片由一个图案化的电极板和一个ITO接地板组成，两者之间有约500微米的间隙，可实现稳定的液滴传输、分割、合并和混合。引入了亲水成像位点以在信号读出过程中固定液滴。
为了验证DMF的性能，进行了液滴...
DMF平台的设计和性能评估
在这项研究中，我们设计了一个稳健的DMF平台来执行我们的“混合-测量”免疫分析协议。便携式DMF控制器（15 × 20厘米，重量< 1千克）与笔记本电脑连接，可实现电极的编程控制，从而实现自动液滴操控（图2A）。作为概念验证，我们定制设计的DMF芯片每个操作周期可以并行测试7个不同的样本，每个样本可以同时定量3种生物标志物，实现了...
结论
这项工作建立了iDMF-mLOCI，这是一个统一且简约的POCT平台，它结合了数字微流控技术（DMF）的精确、可编程液滴操控、无需清洗的mLOCI免疫分析和芯片内原位血浆分离，从而实现了高度简化、灵敏且稳健的多重蛋白质定量系统。该系统使用微升级微量样本实现了快速、高灵敏度和准确的多目标分析，同时完全消除了清洗步骤...
CRediT作者贡献声明
李卓如：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据分析、数据管理。
郭庆生：软件开发、研究、概念设计。
张海波：研究。
毛恩强：监督。
王尧：资源获取。
徐洪：撰写——原始草稿、监督、项目管理、研究、资金获取、概念设计。
赵冰：监督
未引用的参考文献
世界卫生组织，2023年。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
数据可用性
数据将应要求提供。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文报告的工作。
致谢
本项工作得到了国家重点研发计划（项目编号：2023YFB3210301）、中央高校基本科研业务费（项目编号：YG2024ZD12）和国家自然科学基金（项目编号：82272122）的支持。作者还感谢胡从玉博士在本工作早期阶段提供的有益讨论。
