《Diversity》：Reassessment of the Taxonomic Identity of Artemia (Crustacea: Anostraca) from Kyêbxang Co (Tibet): Evidence for Artemia sorgeloosi Rather than Artemia tibetiana
Chaojie Yang,
Zijian Chen,
Alireza Asem,
Amin Eimanifar,
Chun-Yang Shen,
Hongyue Zhang,
Chuan Jia and
Michael Wink
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本研究对西藏解布乡错（Kyêbxang Co）的丰年虫种群进行了精确的生物系统学评估。通过线粒体全基因组和COI基因单倍型分析，发现该种群在系统发育中稳定归属于素氏丰年虫（Artemia sorgeloosi）分支，而非先前认为的西藏丰年虫（Artemia tibetiana），其遗传距离也支持这一结论。这解决了该种群长期以来的分类学争议，并强调了对青藏高原特有物种进行准确鉴定对生物多样性理解和生态系统管理的重要性。
1. 引言
准确的物种鉴定是评估和理解生态系统生物多样性的基础。然而，对于许多类群，特别是存在隐存种或种内形态变异大的情况，物种鉴定仍然具有挑战性。丰年虫属（Artemia）就是这样一个分类学上棘手的类群，其物种界定长期以来因缺乏可靠、通用的鉴定标准而复杂化。
亚洲自然分布的丰年虫物种包括乌尔米亚丰年虫（Artemia urmiana）、中华丰年虫（Artemia sinica）和西藏丰年虫（Artemia tibetiana），以及最近描述的两个物种：素氏丰年虫（Artemia sorgeloosi）和阿玛蒂丰年虫（Artemia amati）。青藏高原平均海拔超过4000米，具有极端环境条件，是多种丰年虫的分布区。
自2008年以来，青藏高原丰年虫的分类学存在越来越多的不确定性和争议。早期基于线粒体COI序列数据的分子工作揭示了西藏种群中存在两个不同的进化谱系，后续研究进一步证实了这一模式。为了解决这一分类学模糊性，最近的研究应用了整合分类学框架，将第二个多系分支正式描述为新物种——素氏丰年虫。
然而，近年来对来自解布乡错（Kyêbxang Co）的丰年虫种群的研究，对其分类地位的认定存在不一致。有研究将其间接称为素氏丰年虫，而后续的另一项研究在缺乏分类学证据的情况下，又将其命名为西藏丰年虫。这凸显了对解布乡错种群分类地位进行重新评估的必要性。本研究旨在利用有丝分裂基因组数据和从线粒体COI条形码标记推断的种群遗传结构，重新考虑解布乡错种群的分类学地位，以确定其应归属于素氏丰年虫还是西藏丰年虫。
2. 材料与方法
本研究对来自其模式产地的两个青藏高原区域特有丰年虫物种（西藏丰年虫和素氏丰年虫）以及解布乡错种群进行了检测。为帮助分子分析和物种界定，研究中还包含了另外三个亚洲物种（乌尔米亚丰年虫、中华丰年虫和阿玛蒂丰年虫）以及美洲物种佛氏丰年虫（作为外群）。本研究仅分析了有性生殖物种，以构建解布乡错种群与亚洲有性丰年虫之间母系关系的清晰、特定的系统发育结构。
利用解布乡错丰年虫一个雄性个体的基因组DNA序列，我们定位了其完整的线粒体基因组。使用乌尔米亚丰年虫的线粒体基因组作为参考，遵循既定方法进行了组装和注释。为了确定解布乡错种群的分类地位，基于13个蛋白质编码基因（PCGs）和2个核糖体RNA（rRNAs）的串联比对，从有丝分裂基因组序列推断出系统发育树。采用了两种不同的建树方法：贝叶斯推断（BI）和最大似然法（ML）。
基于13个PCGs和2个rRNAs的串联序列，计算了解布乡错种群与各亚洲物种之间的遗传距离。使用未校正的p-距离模型进行计算，并将所得距离以热图形式可视化。此外，利用线粒体COI基因标记来追踪解布乡错种群单倍型相对于亚洲物种的分布模式。单倍型之间的谱系关系通过中值连接算法和TCS方法进行分析。
3. 结果
来自解布乡错的被检测样本组装出的完整线粒体基因组是典型的环状DNA，包含13个PCGs、2个rRNAs、22个tRNAs和一个非编码控制区，总长度为15,736 bp。有丝分裂基因组和PCGs+rRNAs序列的A+T含量分别为62.77%和62.09%。
ML和BI分析产生了一致的树拓扑结构。系统发育重建表明，解布乡错丰年虫聚集在素氏丰年虫分支内，与西藏丰年虫呈现多系关系，而西亚的乌尔米亚丰年虫谱系则位于这两个西藏类群之间。这一结果得到了遗传距离值的支持：解布乡错丰年虫与素氏丰年虫的遗传距离为0.31%，而与西藏丰年虫的遗传距离为9.07%。
基于线粒体COI标记的单倍型网络分布分析表明，解布乡错种群仅与素氏丰年虫共享单倍型。然而，无论是中值连接模型还是TCS模型都表明，在解布乡错种群的网络模式中，存在异常大量的缺失中间和/或未采样的单倍型。此外，在解布乡错种群网络中，相对较多的单倍型是以单态单倍型（singleton haplotypes）的形式存在的，并形成一个线性结构，每个单倍型与下一个仅相差一或两个核苷酸替换，而中值连接模型则显示出更复杂的结构。
4. 讨论
青藏高原拥有两个区域特有的有性物种：西藏丰年虫和素氏丰年虫。有研究表明，西藏丰年虫和新描述的素氏丰年虫代表了一个“线粒体-核基因不一致”的案例，并提出了杂交起源的可能性。系统发育分析表明，素氏丰年虫谱系在上新世早期/中新世晚期（约4.85百万年前）发生分化，早于西藏丰年虫谱系在晚更新世（约0.37百万年前）的出现。这些结果清楚地表明这两个类群是独立的生物物种。
最近的研究包含了关于解布乡错种群的数据，但其分类学指定仍然不一致且支持不足。一项研究将该种群鉴定为西藏丰年虫，但其线粒体COI系统发育将其置于包含拉果湖模式产地种群的分支之外，且未提供明确的分类学依据。另一项研究检查了同一种群的核内变异，其提交的COI序列被标记为素氏丰年虫，但该研究未应用正式的分类学框架或提供物种界定的证据。随后的染色体水平基因组组装研究将该种群称为西藏丰年虫，同样没有提供分类学分析或证据来证实这一物种归属。因此，解布乡错种群的分类学地位仍然悬而未决。
本研究中，有丝分裂基因组系统发育树的拓扑结构明确表明，解布乡错种群聚集在素氏丰年虫分支内，其相对于西藏丰年虫和素氏丰年虫的遗传距离进一步支持了这一系统发育推论。本研究构建的线粒体COI单倍型网络显示，解布乡错种群与来自海晏湖的素氏丰年虫模式产地种群共享其母系基因库。然而，我们在解布乡错种群的单倍型网络中检测到了一个异常模式。具体而言，该网络显示出大量缺失和/或未采样的中间单倍型，表现为大量以线性结构排列的单态单倍型，这可能反映了序列质量不佳，例如忽视了色谱图中的双峰或多峰信号，或者可能是由于扩增出了核内线粒体假基因。未解决的色谱图峰会人为地夸大单倍型多样性，产生虚假分支，并模糊潜在的谱系结构。
因此，我们建议相关研究的作者应仔细重新审视所报告的序列数据，以确认数据集是否受到多峰特征的影响。总体而言，分子分析的结果清楚地表明，解布乡错种群属于新鉴定的物种素氏丰年虫。尽管素氏丰年虫先前已在西藏被描述并主要从西藏地点报道，但不清楚为何后续的调查在很大程度上忽视了这些记录，而没有进行系统的重新评估或批判性审查。如果对素氏丰年虫描述的有效性存在疑问，那么在后续研究中缺乏明确的评估、反驳或比较分析则构成了一个重大的方法学缺陷。
5. 结论
鉴于近期有报告证实外来物种佛氏丰年虫在青藏高原的出现，这对当地生物多样性和高盐生态系统的稳定性具有潜在的严重影响，因此对西藏本土丰年虫种群进行精确的分类鉴定变得尤为紧迫。然而，对现有文献的审查表明，许多近期研究未能充分遵循核心的分类学和生物系统学标准，经常在没有明确阐述诊断特征或采用正式物种界定方法的情况下分配物种名称。
总的来说，这些问题凸显了对先前关于青藏高原丰年虫多样性解释进行全面重新评估的必要性，同时需要实施一个牢固植根于当代分类学和生物系统学原则的整合分类学方法。本研究利用有丝分裂基因组和种群遗传学证据，最终明确地将西藏解布乡错的丰年虫种群归类为素氏丰年虫，而非西藏丰年虫，从而解决了该种群长期存在的分类学模糊性，为理解该地区的生物多样性提供了更清晰、更准确的框架。
