《Diversity》：Cultivable Foliar Endophytic Fungal Community in Endemic Mexican Quercus Species Across a Forest–Avocado Orchard Landscape
María Isabel Méndez-Solórzano,
Ken Oyama,
Pablo Cuevas-Reyes,
Yurixhi Maldonado-López and
Gerardo Vázquez-Marrufo
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本文通过评估两种墨西哥特有栎树叶部可培养内生真菌多样性，揭示了森林-果园景观梯度对群落结构的影响，表明森林向果园的转变导致栎树相关真菌群落结构改变及多样性下降的趋势。该研究强调了土地利用变化对微生物多样性的潜在生态影响，为理解生态系统韧性提供了基线数据。
引言：森林、橡树与牛油果的冲突
温带橡木林是生物多样性丰富的生态系统，而墨西哥是栎属植物多样化的主要中心，拥有高度的物种特有性。然而，在米却肯州（墨西哥中部），牛油果种植业的快速扩张导致橡木林覆盖面积减少，景观破碎化加剧。叶部内生真菌可以在生物和非生物胁迫下促进宿主的表现，但人们对它们在墨西哥特有橡木中的多样性及其对土地利用变化的响应仍知之甚少。本研究旨在表征墨西哥特有栎种 Quercus castanea和 Quercus obtusata叶片相关的可培养内生真菌群落，并评估内生真菌多样性和群落组成如何随着森林和牛油果园覆盖比例不同的景观而变化。这项研究为理解牛油果种植扩张如何影响温带森林这一生物多样性热点地区的橡木相关内生真菌提供了新的见解。
材料与方法
研究在墨西哥米却肯州牛油果种植区进行，于2021年12月在六个森林与果园覆盖比例不同的地点采样。这些地点分为森林主导（F > O）、森林-果园混合（F = O）和果园主导（F < O）。从每个地点的 Q. castanea和 Q. obtusata成年树上采集健康叶片。叶表面经过严格灭菌后，将叶片组织片段接种在添加抗生素的马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上，在28°C黑暗中培养以分离真菌。从生长的菌落边缘取菌丝体进行纯化培养，建立无菌菌株。
菌株根据在PDA上的菌落宏观形态和显微镜下的微观特征（如形状、颜色、边缘、纹理、存在分泌物、培养基颜色变化等）进行形态学分类。通过苯酚-氯仿法提取DNA，并使用通用引物ITS1和ITS4扩增核糖体内部转录间隔区（ITS）序列。测序后，将所得ITS序列与NCBI数据库进行比对。基于最高相似度（≥99%）结果，结合属级别的系统发育分析，对菌株进行分类学鉴定。多样性在属水平进行评估，使用Margalef指数评估属的丰富度，并使用Shannon指数、Simpson指数和Pielou均匀度指数评估群落多样性及均匀度。统计分析在Past软件中进行，并使用自举法计算了95%置信区间。
结果
3.1. 从 Q. castanea和 Q. obtusata中分离到的叶部内生真菌的鉴定
从栎树叶片中，共分离到112株可培养的叶部内生真菌菌株（每个树种各56株），鉴定出95个不同的形态型。所有分离株均属于子囊菌门，归属于4个纲、10个目、32个属。其中，Sordariomycetes纲最为丰富（68.68%），其次是Dothideomycetes纲（25.25%）。相对丰度最高的属是 Nigrospora(8%)、Xylaria(7%)、Nodulisporium(6%) 和 Daldinia(6%)。在丰度最高的几个属中，系统发育分析支持了部分分离株（如 Nigrospora的某些菌株）鉴定到 Nigrospora sphaerica的种水平，而其他属如 Nodulisporium和 Daldinia则无法精确鉴定到种。因此，随后的多样性分析主要在属水平进行。
3.2. 内生真菌属在森林-果园覆盖类别中的分布
对不同景观类型下的真菌属分布进行分析发现，总体而言，森林主导（F > O）地点的属数最多（27个），混合（F = O）地点有17个，而果园主导（F < O）地点仅有12个。Colletotrichum、Neofusicoccum、Nigrospora、Diaporthe、Daldinia和 Xylaria这6个属在所有三类地点中均有出现。有10个属为F > O地点所独有，而F < O地点仅有一个独有属。在单个树种层面，Q. castanea在F > O、F = O、F < O地点分别鉴定出18、12、9个属；Q. obtusata则分别鉴定出19、12、7个属。韦恩图清晰地展示了属在不同景观类型间的共享和独有模式。
3.3. 丰富度和多样性指数
对多样性指数的分析显示，与两种栎树相关的叶部内生真菌多样性呈现出从森林主导（F > O）到混合（F = O）再到果园主导（F < O）地点逐步递减的一致梯度模式。Shannon指数和Margalef丰富度指数在F < O地点值最低，在F = O地点为中等，在F > O地点值最高。Simpson多样性指数在所有地点都较高（>0.94），表明分类学上的优势度较低。Pielou均匀度指数也普遍较高（>0.78）。95%置信区间分析支持了这一趋势，尤其是在多样性指数的极端值（F > O vs. F < O）之间几乎没有重叠，表明群落结构的变化模式具有一致性。此外，在两个树种之间比较，Q. castanea的丰富度和多样性（Shannon和Margalef指数）总体上高于 Q. obtusata，特别是在F > O地区。
讨论
本研究首次对墨西哥特有栎树 Q. castanea和 Q. obtusata叶部可培养内生真菌群落进行了表征。结果表明，森林主导地区的属丰富度更高，且拥有更多特有类群，这与森林向果园的转化与栎树相关真菌群落结构变化及多样性下降的趋势相关的假设一致。所发现的真菌群落以子囊菌门为主，这与全球其他地区栎树内生真菌的研究结果一致。然而，优势属（如 Nigrospora、Xylaria、Nodulisporium、Daldinia）的组成与欧洲、亚洲和北美栎树研究中报道的优势类群有显著差异，突出了橡木内生菌群存在强烈的生物地理分化，地理背景和局部环境条件可能比宿主属的身份更能塑造内生群落组成。
尽管基于ITS序列的系统发育分析能够对部分菌株（如 Nigrospora sphaerica和 Nectria pseudotrichia）进行种级鉴定，但许多内生真菌仅能鉴定到属水平。这反映了ITS区域作为单一标记在真菌鉴定中的局限性。因此，本研究在属水平进行多样性分析是一个稳健且保守的方法。研究采用了培养依赖的策略，这有助于获得活体材料用于未来的功能研究，但也承认该方法可能低估了总的内生多样性，因为快速生长或易于产孢的真菌可能被过度代表。尽管如此，跨宿主和跨景观梯度群落模式的一致性表明，培养依赖的数据捕捉到了橡木相关内生真菌对景观改变的有意义的生物学响应。
研究观察到真菌多样性主要受森林-果园环境梯度的结构化影响，宿主身份也表现出次级但一致的影响。Q. castanea显示出比 Q. obtusata更高的丰富度和多样性，这可能反映了与宿主相关的特性差异，如叶片化学、冠层结构或促进真菌定殖的微生境可用性。值得注意的是，Nigrospora和 Xylaria在两个宿主的所有覆盖水平中均有出现，表明这些属可能构成了墨西哥栎树叶部核心内生真菌组的一部分。
结论
本研究表明，墨西哥特有栎种 Quercus castanea和 Q. obtusata拥有丰富的、以子囊菌门为主的可培养叶部内生真菌群落。在森林-牛油果园林地梯度上，森林主导地区始终支持更高的属丰富度和更多的特有分类单元。这些结果表明，景观环境与墨西哥特有栎树中可培养内生真菌的多样性模式相关。尽管基于有限的采样设计，这项工作提供了基线证据，表明森林向果园的转化与栎树相关真菌群落的变化有关，并强调了需要采用结合培养依赖和培养非依赖的整合性方法，来进一步评估其生态和功能意义。
