编辑推荐：
本研究发现，在神经元而非星形胶质细胞中特异性敲除Per1基因，会导致小鼠的昼夜节律周期缩短，并显著削弱了其在主观夜间晚期（CT22）接受光照后的相位前移反应。研究揭示了Per1在两种细胞类型中的不同功能：星形胶质细胞中的Per1对行为节律影响甚微，而神经元中的Per1对调控节律周期和介导光照引起的相位前移至关重要。这一发现深化了我们对核心时钟基因Per1在特定细胞类型中功能的认知，为理解昼夜节律紊乱相关疾病的机制提供了新视角。
引言
昼夜节律系统使生物体能预判每日周期性事件，并将内部节律与环境信号（如光照）同步，以适应昼夜循环。在分子机制层面，核心时钟基因Period (Per) 1和2是生物钟和光感的核心。尽管Per2在星形胶质细胞和神经元中的作用已被阐明，但Per1的具体贡献仍不甚清晰。先前研究表明，神经元而非星形胶质细胞中的Per2影响相位移动，而昼夜节律周期的调控则涉及两种细胞类型中的Per2。本研究旨在探究Per1在神经元和星形胶质细胞中对调节昼夜节律周期和相位移动的作用。
在细胞水平，哺乳动物的生物钟通过一个约24小时的转录-翻译反馈环运作。核心时钟基因包括Bmal1和Clock（或其同源基因Npas2），它们激活Per和Cry基因的转录，后者反过来抑制其自身的激活，形成一个负反馈环。核受体REV-ERBα和RORα通过分别抑制或激活Bmal1、Clock和Npas2的转录来进一步调控其表达，从而完善核心时钟机制。此机制可通过以下方式被调节：(1) 与核受体结合的分子，如作用于PPARα和REV-ERBα的游离脂肪酸和糖皮质激素；(2) 间接通过谷氨酸及其受体。
昼夜节律行为活动主要受光调控。光照强度的变化会触发适应性反应，根据暴露时间的不同，使生物体的活动相位提前或延迟。例如，在主观夜间晚期（如昼夜节律时间22，CT22）给予15分钟光脉冲会使时钟相位提前，而在主观夜间早期（如CT14）给予光照则会使其延迟。在细胞水平，光刺激会促进与昼夜节律系统主起搏器——视交叉上核（SCN）相连的突触释放神经递质（如谷氨酸）。这导致即早基因（如Fos）和时钟基因（如Per1和Per2）的诱导。
值得注意的是，小鼠所有细胞中Per2基因的突变会缩短昼夜节律周期，减弱相位延迟，并增强相位提前。相比之下，全局性敲除Per1仅缩短周期并减少相位提前。在星形胶质细胞或神经元中细胞类型特异性敲除Per2也会缩短时钟周期，但只有神经元敲除会影响相位移动。Per1在星形胶质细胞和神经元中关于周期调节和相位移动的独特作用尚不清楚。因此，我们研究了Per1在这些细胞类型中对昼夜节律周期和光诱导相位移动反应的贡献。
结果
Per1在神经元或星形胶质细胞敲除小鼠中缺失
为研究Per1在调节昼夜节律周期和光反应性中的细胞类型特异性作用，我们构建了星形胶质细胞特异性（Per1G；Per1/Gfap-Cre）和神经元特异性（Per1N；Per1/Nes-Cre）的Per1敲除小鼠。通过在ZT12时间点采集视交叉上核组织并进行PER1特异性抗体免疫组化，我们证实了在神经元敲除小鼠中，神经元内PER1表达缺失；在星形胶质细胞敲除小鼠中，星形胶质细胞内PER1表达缺失，表明在这两种细胞类型中成功实现了Per1的特异性敲除。
缺乏Per1表达的神经元或星形胶质细胞敲除小鼠未消除昼夜节律性，但略微减少了Per1NKo动物的相位提前
为评估缺乏神经元或星形胶质细胞Per1的小鼠对光的反应，我们采用Aschoff I型方案，在恒定黑暗条件下评估光诱导的快速相位移动。所有小鼠品系均饲养在恒定黑暗中，可接触跑轮，其运动活动被记录并以双图活动图显示。在恒定黑暗中约10天后，动物在昼夜节律时间10、14和22接受15分钟光脉冲。根据相位反应曲线，选择CT10的光脉冲作为对照，因为该时间点处于相位反应曲线的“死区”，理论上不应诱导相位移动反应。选择CT14和CT22是因为它们分别代表相位反应曲线中强烈的相位延迟或提前反应。
定量分析显示，CT10的光脉冲对所有品系均无显著影响。CT14的光脉冲诱导了所有组别一致的相位延迟。然而，CT22的光脉冲导致除Per1NKo小鼠外所有品系的相位提前，与神经元对照组相比，Per1NKo小鼠表现出显著减弱的相位提前。这些发现表明，神经元而非星形胶质细胞中的Per1表达参与了介导光诱导的昼夜节律行为相位提前。
缺乏Per1神经元的小鼠周期缩短，且CT22的光照会缩短每个品系的周期
利用跑轮活动记录衍生的活动图，我们评估了所有小鼠品系的昼夜节律周期。值得注意的是，只有在神经元中缺乏Per1的小鼠在无光脉冲的基线条件下，表现出比其神经元对照组显著缩短的昼夜节律周期。这一发现与之前关于全局性Per1敲除小鼠相位提前减少的报告一致。
我们接下来检查了不同昼夜节律时间的光脉冲是否影响周期。CT10的光脉冲对所有基因型的周期均无显著影响。同样，CT14的光脉冲也未改变所有品系的周期。有趣的是，CT22的光脉冲导致了所检测的每个基因型的昼夜节律周期显著缩短。这表明，在CT22激活了一条对光敏感的信号通路，且无论Per1在神经元或星形胶质细胞中是否被敲除，该通路都保持功能。此外，我们观察到，与神经元对照组相比，Per1NKo小鼠因CT22光脉冲导致的周期缩短程度更大。这表明神经元的cre-driver品系本身并非导致Per1NKo小鼠周期缩短的原因。
Per1NKo小鼠的振幅和相位相对功率降低
我们评估了所有基因型的昼夜节律振幅，发现给予CT10、CT14和CT22的光脉冲并未显著改变野生型、Per1NKo、GCo和Per1GKo小鼠的振幅。在神经元对照组动物中，观察到CT10和CT22的振幅发生变化。然而，Per1NKo小鼠与其神经元对照组相比，振幅显著降低，表明在缺乏神经元Per1的情况下，昼夜节律振荡器可能被削弱。
为了进一步研究振荡器强度，我们量化了每个基因型的相位相对功率。CT10、CT14和CT22的光脉冲不影响各基因型内部的相位功率。与观察到的周期缩短和振幅降低一致，Per1NKo小鼠在光脉冲前后均表现出比对照组显著更低的相位相对功率。有趣的是，在CT22光脉冲后，Per1GKo小鼠的相位功率相对于其GCo对照组受到了影响。总的来说，这些观察结果表明Per1NKo小鼠的振荡器较弱。
总的跑轮活动表明，除Per1NKo小鼠与其神经元对照组相比存在差异外，敲除品系与其各自的对照组之间没有差异。有时光脉冲会影响总活动量，如在神经元对照组和Per1NKo小鼠中观察到的那样。这些观察表明，所见的效应可能会影响其他一些昼夜节律参数，但总活动量对相位移动的影响可能很微小。
讨论
在本研究中，我们利用跑轮活动作为行为范式，探究了Per1基因在神经元和星形胶质细胞中缺失如何影响昼夜节律周期和相位。我们的实验表明，星形胶质细胞中Per1的敲除对这些参数没有或仅有微弱影响。相比之下，神经元中Per1的缺失导致昼夜节律周期缩短，并削弱了在CT22给予光脉冲后的相位提前反应。
先前的研究报告称，在大鼠脑器官型SCN切片培养物中，星形胶质细胞内的Per1::luc报告基因表达检测不到。然而，在源自大鼠皮质组织的培养星形胶质细胞中观察到了Per1::luc节律。这种差异表明，星形胶质细胞中的Per1表达可能显著低于神经元，或者更为弥散，而在神经元中Per1::luc表达很容易被检测到。我们的免疫组化数据支持这一解释：我们观察到PER1蛋白在SCN神经元中表达较高，而在星形胶质细胞中明显较低。
与这些发现一致，在缺乏星形胶质细胞Per1的小鼠中，评估的大多数行为昼夜节律参数与其星形胶质细胞对照组相似。相位移动未受影响，周期具有可比性，振幅正常，相位相对功率在CT22光脉冲后除外也未改变。总的跑轮活动也与对照动物相匹配。这些结果表明，星形胶质细胞Per1在调控体内行为昼夜节律参数方面作用甚微，甚至没有作用。
相比之下，神经元中Per1的敲除导致光诱导相位提前减少、周期缩短、振幅降低，最终导致相位相对功率降低——这些都是昼夜节律振荡器减弱的迹象。值得注意的是，这些变化很可能不是由于总的跑轮活动量的差异所致，尽管在接受CT22光脉冲的动物中观察到了差异。这些发现与先前的报告一致，并强化了Per1主要通过神经元机制而非星形胶质细胞机制影响行为昼夜节律参数的观点。
几项研究表明，SCN中的Per1表达可由短暂的光照诱导。此外，小鼠全局性敲除Per1已被证明会损害相位提前而不影响相位延迟，这表明光诱导的Per1表达与相位提前特异性相关。我们的发现支持并扩展了这一观点，表明神经元而非星形胶质细胞中的Per1表达对于光诱导的相位提前很重要。
在Per1NKo小鼠中观察到的相位提前减少不能仅归因于CT22光诱导的周期缩短。所有基因型在CT22光脉冲后都表现出周期缩短，这可以解释为第二天活动开始时间提前，从而导致了图中观察到的相位提前。这种效应在Per1NKo小鼠中也存在，并且神经元对照组与Per1NKo小鼠之间的周期差异在光脉冲后增大，Per1NKo小鼠表现出更短的周期。如果单是周期缩短导致了相位提前，那么预计Per1NKo小鼠会比对照组表现出更大的提前。然而，观察到的却是相反的情况，这表明Per1在CT22光反应相位提前中的作用涉及一条不同于其在周期调控中作用的分子通路。
Per1和Per2基因的功能似乎是不同的，当比较它们在神经元和星形胶质细胞中的作用时，这种区别就很明显。在这项研究中，我们发现神经元而非星形胶质细胞中的Per1对调节周期和相位提前至关重要。相比之下，Per2在两种细胞类型中都影响周期，但只有神经元中的Per2对相位延迟至关重要。这种功能分离与先前的报告一致，即Per1报告基因表达主要是神经元性的，而Per2报告基因表达更局限于非神经元群体。我们的发现也证实了最近的一项研究，该研究表明星形胶质细胞调节SCN的昼夜节律周期，但不调节相位。
我们的研究有几个局限性需要指出。首先，评估星形胶质细胞中Per1的存在与否具有挑战性。蛋白质印迹和原位杂交等技术缺乏选择性测量星形胶质细胞Per1水平所需的灵敏度。虽然在FACS分选星形胶质细胞后进行PCR分析将提供更可靠的数据，但这种方法需要大量动物，不切实际。因此，我们依赖于免疫组化，虽然不能定量，但能合理指示星形胶质细胞中的Per1水平。考虑到这一局限性，关于星形胶质细胞中缺乏Per1的结论应谨慎解释。其次，我们不能排除光诱导的对昼夜节律周期的影响促成了观察到的相位提前。
尽管Per1和Per2基因在同一个分子自动调节反馈环中起作用，但这项研究表明它们的相对贡献可能因细胞类型而异。这种差异使得细胞类型特异性输出机制以及细胞类型依赖性对时钟相关感觉输入的反应能够被差异化调节。这一观点得到了以下发现的支持：Per1和Per2控制着不同的时钟调节基因集，从而对行为产生不同的影响。最近的研究表明，功能分区可以发生在细胞类型特异性振荡器的水平。总之，这些见解强调了如何利用Per基因的细胞类型特异性敲除来解决昼夜节律生物学中的基本问题，并探索昼夜节律定时在细胞增殖、睡眠以及神经系统疾病（包括阿尔茨海默病）发展等过程中的作用。
总之，本研究表明星形胶质细胞Per1对昼夜节律调控的重要性似乎有限，而星形胶质细胞Per2有助于周期控制，但不参与光介导的相位移动。在神经元中，两种Per旁系同源基因都必不可少：Per1用于相位提前，Per2用于相位延迟。
