《Poultry》：Inclusion Body Hepatitis (IBH) Outbreaks Following Vertical Transmission of Fowl Adenovirus Serotype 11 (FAdV-11), Species D: A Strain with Regional Persistence and Global Presence
Beatrice Grafl,
Peter Mitsch,
Ernst Wiesinger,
Josef Ziegerhofer,
Ivana Bilic,
Claudia Hess,
Dieter Liebhart and
Michael Hess
编辑推荐：
本报告描述了奥地利罗斯308肉鸡群中由禽腺病毒（FAdV）血清11型（FAdV-D）经垂直传播导致的包涵体肝炎（IBH）暴发事件。通过对发病鸡群、种鸡群及死胚的临床、病理、分子与血清学系统调查，首次在现场条件下确证了FAdV-11的垂直传播机制及其在子代肉鸡中引发IBH的全链条过程。该研究揭示了FAdV-D单毒株在区域的持续性循环，凸显了种鸡场和孵化场生物安全与针对性免疫防控在控制IBH中的关键流行病学意义。
引言：禽腺病毒与包涵体肝炎
禽腺病毒（Fowl Aviadenoviruses, FAdVs）属于腺病毒科禽腺病毒属。根据分子标准可分为A到E五个种，基于交叉中和试验可分为12个血清型（FAdV-1至-8a及-8b至-11）。FAdVs作为原发性病原体的作用已在包涵体肝炎（Inclusion Body Hepatitis, IBH）、肝炎-心包积水综合征和腺病毒性肌胃糜烂的自然暴发中得到证实。IBH主要由血清型FAdV-2、FAdV-11（物种FAdV-D）、FAdV-8a和FAdV-8b（物种FAdV-E）引起，特征性影响5周龄以下的肉鸡。FAdV主要通过粪-口途径水平传播，但其垂直传播（经卵传播）是其主要生物学特征之一。在青年雏鸡中暴发的IBH，常被推测与FAdV的垂直传播有关，但在许多病例中缺乏确凿证据。近年来，全球范围内IBH暴发的报告有所增加。作为一种预防措施，全球范围内的肉种鸡经常接种针对流行FAdV血清型的疫苗，以防止垂直传播并通过母源抗体保护其后代。在奥地利，分子调查已记录了FAdV-D和-E毒株的存在，IBH也已通过病理组织学检查被零星诊断。然而，值得注意的是，当地的种鸡群通常不接种FAdV疫苗，因此它们及其后代在整个生产周期中可能对感染易感。本研究调查了垂直传播在十五个青年肉鸡群自然暴发IBH中的作用，分析了临床数据，并进行了尸检、组织学、病毒学和血清学调查。
材料与方法
病例史与鸡群数据
在2023年12月至2024年2月期间，15个罗斯308肉鸡群在3至15日龄时，突然出现死亡率升高，持续约一周。临床表现为非特异性症状，特别是精神萎靡、羽毛蓬松和扎堆。受影响鸡群的肉鸡来自同一商业孵化场，大多数可追溯到一个或多个嫌疑种鸡群。肉鸡在孵化场接受了标准疫苗接种程序。在IBH暴发期间或之后，几个鸡群还通过饮水接种了传染性法氏囊病疫苗。将病禽或器官样本提交至维也纳兽医大学家禽与鱼类医学诊所进行常规诊断。
肉鸡：尸检、采样与组织病理学调查
对提交的病死鸡进行尸检，记录大体病理变化，并无菌采集肝脏样本用于实验室检查。进行细菌学分析，并将肝脏样本冷冻保存用于病毒分离和PCR检测，或固定在福尔马林中用于石蜡包埋和H&E染色组织学检查。此外，还采集了胸腺、脾脏、骨髓和/或法氏囊样本，混合后用于免疫抑制病毒的PCR检测。
种鸡群采样
从五个嫌疑种鸡群和五个与疫情无关的同期非嫌疑种鸡群采集配对血液样本进行血清学检测。首次采样在IBH暴发前五个月内或暴发早期进行，第二次采样在IBH暴发结束时进行。通过商业酶联免疫吸附试验（ELISA）和病毒中和试验（VNT）检测血液样本。为调查垂直传播，在疫情持续期间，从嫌疑种鸡群的1日龄雏鸡采集泄殖腔拭子。此外，获取了来自嫌疑种鸡群I和III的死胚（Dead-in-shell, DIS），进行尸检并采集肝脏样本，冷冻保存用于病毒分离和PCR。
病毒分离
在14日龄SPF鸡胚肝（CEL）原代细胞上进行病毒分离。制备肝脏样本匀浆或处理泄殖腔拭子样本，过滤后接种近汇合的CEL细胞，观察至接种后5天。在传代三次内观察到细胞病变效应的样本视为阳性。
DNA提取、PCR与序列分析
使用商业试剂盒从肝脏拭子、肝脏样本和细胞培养上清液中提取病毒DNA。使用已发表的引物和方案扩增FAdV六邻体基因L1环区和针对FAdV-D的纤维基因。对扩增产物进行凝胶电泳分析，纯化正确长度的片段并进行Sanger测序。使用生物信息学软件进行序列组装、比对和系统发育分析。系统发育分析基于与参考毒株对齐的六邻体基因片段，采用邻接法构建进化树。此外，还使用标准实验室RT-real-time和常规PCR方案筛查了肉鸡样本中的鸡传染性贫血病毒（CAV）和传染性法氏囊病病毒（IBDV）。
血清学调查
使用商业FAdV ELISA试剂盒进行检测和评估。对于VNT，血清在56°C灭活30分钟。采用固定病毒稀释血清法进行VNT，使用FAdV-11毒株。抗体滴度≤3 log2被视为阴性。
结果
肉鸡：生产数据
在IBH暴发期间，受影响肉鸡群的死亡率在大约6至8天内升高。15个调查鸡群的累积死亡率在2%至27%之间。如图1a所示，与后期受影响的鸡群相比，在IBH暴发后不久孵出的鸡群观察到更高的累积死亡率。总体而言，受影响鸡群中存活的肉鸡在屠宰时达到目标体重，屠宰场的废弃率没有显著增加。
肉鸡：病理形态学变化、微生物学与分子诊断
肉鸡尸检观察到肝脏肿胀、易碎，表面斑驳，有弥漫性坏死灶和点状出血（图1b）。部分肉鸡胰腺表面有坏死灶，肾脏苍白、水肿。其他器官未见明显病变。组织病理学显示，患病肉鸡肝脏样本中存在多灶性变性和坏死区域。在变性和坏死的肝细胞核内观察到大的核内包涵体（图1c）。此外，在肝实质中检测到由单核细胞和异嗜细胞聚集形成的局灶性炎症区域。肝脏样本中未分离到致病菌。在所有15个受影响肉鸡群的肝脏中，通过病毒分离和/或PCR均检测到FAdV。对阳性PCR产物（包括六邻体基因L1环区）进行测序，显示肉鸡来源毒株的核苷酸序列完全相同。基于六邻体基因与GenBank中FAdV-1至-8a和-8b至-11参考毒株序列的系统发育分析，将其鉴定为FAdV-D，血清型11，与GenBank中的参考毒株380具有97.6%的核苷酸同一性（图2a）。纳入来自奥地利肉鸡场（2015-2022年）的另外八个FAdV-D六邻体序列，揭示了完全的序列同一性，证明自2015年以来，奥地利鸡群中持续存在单一FAdV-D血清11型毒株的循环。纤维基因的分析部分显示彼此间具有99.9-100%的核苷酸同源性，与FAdV-11参考毒株380的核苷酸序列同源性为95.1%。病毒共感染检测显示，两个鸡群（4号和6号）IBDV检测为阳性。在所有15个农场的IBH患病肉鸡样本中均未检测到CAV。
种鸡：孵化场样本结果
部分被检查的死胚具有易碎的肝脏，表面斑驳，有弥漫性坏死灶和点状出血（图3）。虽然病毒分离为阴性，但通过PCR在来自种鸡群I的死胚肝脏样本中检测到FAdV。六邻体基因PCR产物的序列分析将其鉴定为FAdV-D，血清型-11。获得的序列与肉鸡样本相比，在位置314有一个单核苷酸多态性（99.9%序列同一性）（图2b）。在死胚中检测到FAdV-11 DNA表明存在垂直传播，将种鸡感染与子代疾病联系起来。
来自种鸡群III的死胚样本和从嫌疑种鸡群1日龄子代雏鸡采集的泄殖腔拭子样本检测结果均为阴性。
种鸡：血清学结果
通过ELISA检测的所有血清样本均为阳性，且滴度较高。比较所有嫌疑和非嫌疑本地种鸡群的平均ELISA滴度，在第一次和第二次采样之间普遍观察到滴度上升。然而，嫌疑种鸡群的平均滴度低于非嫌疑鸡群（分别为15,629至19,454和20,781至24,753；图4a）。使用VNT检测，在第一次采样时，来自嫌疑种鸡群的80份血清样本中有24份对FAdV-11的中和抗体呈阳性。其中三分之一（10份阳性样本中的8份，具有低水平FAdV-11中和滴度）在种鸡群II中检测到，该群在IBH暴发早期进行了首次采样。嫌疑种鸡群在第一次采样时的总体平均滴度为3.53±1.02。第二次采样时，嫌疑种鸡群的100份样本中有70份呈阳性，总体平均滴度为6.71±2.33；然而，种鸡群V的样本大多仍为阴性（图4b）。这些血清学发现表明，在疫情暴发期间，嫌疑种鸡群存在持续感染。相比之下，在非嫌疑种鸡群的165份样本中，有164份检测到针对FAdV-11的病毒中和抗体。总体平均滴度始终较高，第一次和第二次采样时分别为10.50 log2和11.56 log2。
2视为阴性。种鸡群I、II、IV、V和VI被怀疑与IBH暴发中的垂直传播有关。非嫌疑种鸡群VIII至XII是同时期与疫情无关的本地鸡群。">
讨论
本研究描述了奥地利十五个肉鸡群在八周内发生的IBH暴发。与先前IBH暴发的观察一致，主要的病理学发现是严重的肝炎，伴有肿胀、易碎的肝脏，显示出弥漫性坏死灶和点状出血。分子学研究在所有受影响鸡群的肝脏样本中均检测到FAdV-11（FAdV-D）。肉鸡来源的毒株显示出完全的序列同一性，证实FAdV-11毒株是此次IBH暴发的病原。此外，2015年以来所有奥地利FAdV-D六邻体序列相同的发现强烈表明，单一病毒毒株在奥地利肉鸡种群中持续存在并循环了数年。BLAST搜索结果显示超过70条序列具有100%核苷酸同一性，进一步凸显了该毒株的全球分布。与之前关于IBH自然暴发的数据一致，FAdV-D毒株似乎是该疾病流行病学中最重要的病原体之一。FAdV垂直传播的第一个证据是针对CELO（一种FAdV-1毒株）发表的，后来也在肉鸡的腺病毒性肌胃糜烂病例中得到证实。由于受感染禽只年龄小和/或几个鸡群有共同来源，垂直传播经常被认为是所报道的IBH暴发的原因。然而，仅凭这些流行病学数据，在现场条件下不能被视为结论性的，因为FAdV在商品家禽中普遍高度流行，这可能促进了非常早期的水平传播。不幸的是，用于明确确认垂直传播的实验室结果，包括来自亲代种群和患病后代的病毒分离和/或血清学数据，非常有限。本研究中受影响的禽只通常小于2周龄，并且来自同一孵化场，其生产涉及重叠的种鸡群。由于奥地利肉种鸡（在疫情发生时）未进行FAdV疫苗接种，禽只在整个生命周期内对自然感染易感。有假说认为，在早期感染IBH后，种鸡在产蛋高峰期潜伏的感染可能被重新激活，从而导致病毒垂直传播给子代。然而，本研究中的嫌疑种鸡群并非如此，它们没有腺病毒疾病的临床史，血清学调查也表明它们在育成期没有FAdV-11感染。垂直传播可能发生在易感种鸡在生产期间发生急性FAdV感染之后。在本研究中，没有关于肉种鸡发生临床IBH的报告，这与描述成年禽无明显疾病迹象的文献一致。先前一些报告表明，感染FAdV的产蛋禽的孵化率可能受到不利影响。对嫌疑鸡群的回顾性评估显示，孵化率没有明显的负面变化。然而，对来自嫌疑种鸡群的可用死胚进行的尸检显示，其肝脏的宏观变化与在患病肉鸡中观察到的相似。此外，从一个死胚肝脏池中检测到FAdV-11。该FAdV-11毒株的六邻体基因L1环区与疫情暴发期间从肉鸡中获得的FAdV-11毒株近乎完全一致，从而确认了致病性FAdV的垂直传播。不幸的是，未能从额外的死胚肝脏样本和孵化场采集的1日龄子代雏鸡泄殖腔拭子样本中重新分离出FAdV-11，这可能与采样时间点有关。实验研究表明，垂直传播是间歇性的，这限制了从泄殖腔拭子或子代雏鸡器官中检测到病毒。此外，一些作者指出，腺病毒性疾病的垂直诱导是时间限制的，仅限于种鸡群血清阳转期间。对嫌疑种鸡群的配对血清样本检查显示，在首次采样时，针对FAdV-11的特异性中和抗体滴度很低或缺失。第二次采样时，针对FAdV-11的阳性样本数量和平均抗体滴度均有所增加，证实了在研究期间存在急性、持续性的感染。从实验感染的种鸡到其后代的FAdV-4垂直传播据报道可持续长达5周，这与本次研究中受影响肉鸡群疫情暴发的总体时间线一致。单个IBH诱导毒株在特定区域内的存在也凸显了水平引入的持续风险以及建立针对性保护策略的必要性。实验研究已证明FAdV通过粪便水平传播。因此，受污染的媒介物，包括农场设备和人员，已被确定为禽只之间潜在的感染源。此外，腺病毒对环境条件（包括热量和常用消毒剂）的高度抵抗力，即使在存在标准清洁规程的情况下，也促进了现场条件下的水平传播。有趣的是，在本案例中，无法追溯到相关种鸡群的肉鸡群要么是同期孵化，要么与来自相关种鸡群的雏鸡混合。因此，孵化器中或孵化场内雏鸡之间的交叉污染，可能是FAdV早期水平传播和疫情暴发的一个促成因素，原因在于雏鸡在被运往肉鸡农场前的密切接触和处理。类似地，Troxler等人在一次呼肠孤病毒腱鞘炎疫情暴发中观察到，不同来源但在同一天孵化的雏鸡之间的交叉污染是病毒感染的来源和传播途径。观察到的临床症状和疾病进展与先前对IBH暴发的观察结果一致。临床症状以死亡率突然增加为特征，最早在3日龄开始，持续约六至八天。在此期间累积死亡率在2%至27%之间。过去对青年雏鸡暴发的描述也显示死亡率在2%至40%之间。通常，疾病发展和由此产生的死亡率差异受多种因素影响，如受影响鸡的日龄和品种、禽只的健康和免疫状况、病毒感染量、和/或与其他病原体的并发感染。在本研究中，禽只品种相同，饲养条件相似。受影响肉鸡淋巴器官缺乏典型的大体病理变化，以及为保护雏鸡免受IBDV和CAV感染而对肉种鸡实施的免疫程序，表明免疫抑制性疾病在此次疫情中未起重要作用。尽管如此，在两个鸡群中检测到IBDV，这两个鸡群的死亡率处于记录范围内的较高水平。这表明，虽然FAdV-11被确定为所有疫情的主要病原体，但与IBDV的共同感染可能促成了最严重的疫情。同样，Senties-Cué等人报告了部分并发免疫抑制感染的IBH现场疫情具有更高的死亡率。有趣的是，在疫情流行后期受影响的鸡群中，死亡率有降低的趋势，这表明在垂直传播引发的疫情中，病毒感染剂量较低，且母源抗体的保护作用开始显现。与此一致，Mirzazadeh等人报告，抗体水平较低的种鸡群排泄的FAdV-DNA量更高。然而，种鸡病毒排泄与垂直传播之间的联系值得更多关注。
总之，本研究记录了与同一孵化场和种鸡群相关的十五个同期肉鸡群的IBH暴发。数据证实了一个普遍假设，即FAdV-11（一种多年来在不同地区都有报道的毒株）的垂直传播及其随后疾病的表现在肉鸡生产中发生。这凸显了在种鸡和孵化场层面针对FAdV-11实施针对性控制和预防策略的重要性。为种鸡接种针对流行FAdV血清型的疫苗，结合严格的孵化场卫生和监测计划，可显著降低垂直传播和随后在肉鸡群中暴发IBH的风险。
