《Quarterly Reviews of Biophysics》：Cryo-EM of endogenous membrane proteins in their native lipid bilayer
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为解决传统结构生物学方法在膜蛋白研究中面临的挑战，本文综述了如何利用冷冻电镜技术直接研究脂质囊泡和原生脂质双分子层中的内源性膜蛋白。研究人员探讨了这种方法如何规避重组表达和去垢剂提取带来的问题，能够保留蛋白质-脂质相互作用、发现未知亚基，并支持功能性研究，从而揭示了更接近天然状态的膜蛋白结构与功能信息，对理解细胞关键生理过程与药物开发具有重要意义。
细胞如同一个精密的微型都市，其边界——细胞膜——上布满了各式各样的“门卫”和“通道”，它们就是膜蛋白。从感知外部信号的G蛋白偶联受体，到运输物质的离子通道，再到为细胞供能的ATP合酶，这些嵌入脂质双分子层的蛋白质执行着生命的关键功能。若要理解它们如何工作，高分辨率的结构信息是打开奥秘之门的钥匙。然而，长久以来，获得膜蛋白的结构图景是一项艰巨的任务。传统的主力军X射线晶体学，在膜蛋白面前常常“水土不服”：膜蛋白难以重组表达至高浓度，提取它们需要破坏其“家园”——脂质双分子层——的去垢剂，而这种提取过程本身就可能改变蛋白结构，甚至使其失活。更棘手的是，为了形成晶体，通常需要蛋白质分子高度均一、构象一致，这与许多膜蛋白在天然状态下动态多变的本性相悖。尽管冷冻电镜的出现极大地推动了结构生物学，使得无需结晶即可解析蛋白质结构成为可能，但许多研究仍依赖于从膜中提取并纯化的蛋白质，这依然可能导致关键相互作用和天然构象的丢失。
为了回答“如何能在最接近天然环境的条件下解析膜蛋白的结构”这一核心问题，本文综述了利用单颗粒冷冻电镜技术直接研究脂质囊泡和源自细胞的原生脂质囊泡中的内源性膜蛋白这一新兴领域，揭示了该方法在保持膜蛋白天然构象、发现新亚基、以及开展功能性研究方面的独特价值。论文发表在《Quarterly Reviews of Biophysics》上。
研究人员开展本项综述研究，整合了多个已发表的研究案例，重点运用了单颗粒冷冻电镜技术。该方法通过快速冷冻含有目标蛋白的样品，在低温下利用电子显微镜成像，并对单个蛋白质颗粒的图像进行平均和三维重构，从而获得高分辨率结构。研究的样本主要来源于多种生物体系，包括哺乳动物大脑突触囊泡、细菌（如Mycobacterium smegmatis、Methylococcus capsulatus）的质膜、真核生物线粒体内膜，以及利用基因编辑（如CRISPR-Cas）技术处理过的人类培养细胞等。为了从这些复杂体系中富集目标蛋白，研究人员采用了包括亲和层析、特异性抗体或结合蛋白（如纳米抗体、细菌效应蛋白）分离在内的多种生物化学手段。在数据处理方面，应用了诸如Topaz、Vesicle Picker等先进的机器学习和图像识别算法来从复杂的膜泡图像中挑选目标蛋白颗粒，并使用CryoSPARC、Relion等软件进行三维重构和结构分析。
研究结果
内源性蛋白表达可避免重组表达的困扰
研究表明，直接从细胞或组织中分离内源性膜蛋白进行结构解析，可以绕过重组表达的重重困难。许多蛋白质难以高水平表达或难以正确折叠。内源性蛋白结构解析的第一大优势是研究者无需摸索过表达条件。然而，其挑战在于许多内源性蛋白在细胞中丰度不高，而冷冻电镜对样品量要求不菲。尽管如此，这种方法带来了第二个显著优势：经常能发现意料之外的亚基或相互作用。由于一些小而疏水的膜蛋白在凝胶上不易染色，质谱也难以检测，其存在的首个证据往往在从天然来源获得的复合物结构中被发现。例如，对酵母V-ATP酶的研究发现了新亚基f和Voa1p，对哺乳动物V-ATP酶的研究发现了亚基f对应的蛋白RNAseK，对线粒体呼吸链复合物I、Plasmodium falciparum钠外排泵PfATP4的研究均发现了新的结合伴侣。因此，在复合物亚基组成不确定时，直接研究内源性蛋白是极具吸引力的策略。
人类蛋白的冷冻电镜研究
人类蛋白是重要的药物靶点。除非能从血液、胎盘或培养细胞中纯化，否则难以获得内源性人类蛋白的起始材料。因此，人类蛋白的冷冻电镜研究通常采用重组蛋白。通过CRISPR-Cas基因编辑在人类细胞染色体中引入亲和标签，使得从培养细胞中纯化内源性蛋白质复合物成为可能，但哺乳动物细胞培养的成本限制了该技术用于丰度相对较高的复合物。提高冷冻电镜样品制备的“效率”（例如，开发亲和力载网或使用纳升级样品制备设备）可能有助于降低对内源性蛋白样品量的需求。
纯化蛋白的冷冻电镜研究有助于开展还原论实验
虽然人们希望能在完整的活细胞中原位研究所有蛋白质，但目前对于许多蛋白质仍不现实，因为它们在细胞中丰度不高，在拥挤的电镜断层图中难以分辨。而研究纯化的蛋白质则便于开展无法在细胞内轻易完成的控制性还原实验。例如，早期研究通过向样品喷洒乙酰胆碱或在冷冻前用特定波长光照射，分别捕捉了烟碱型乙酰胆碱受体的激活过程和细菌视紫红质的短暂构象变化。近期研究也展示了谷氨酸与离子型谷氨酸受体结合的结构后果。这些在体外进行的实验，能够控制条件、排除混杂因素，使得还原论的结构生物学前景依然广阔。
某些蛋白质的丰度使其可在天然膜中被研究
一些蛋白质（如细菌视紫红质、烟碱型乙酰胆碱受体）天然在特定膜中丰度很高。以最小生化干扰分离这些膜，即可通过电子显微镜进行结构分析。细菌视紫红质在嗜盐古菌Halobacterium salinarum的紫色膜中形成有序二维阵列，适合电子衍射和成像。烟碱型乙酰胆碱受体密集存在于电鳐Torpedo marmorata电器官的突触后膜中，分离的膜易于形成含有蛋白质螺旋阵列的脂质管。在这些膜中成像蛋白质，可确信其处于天然构象，并确保形成天然的蛋白质-脂质相互作用。其他例子，如真核线粒体内膜中密集的氧化磷酸化蛋白复合物，允许对线粒体膜样品进行高分辨率单颗粒冷冻电镜分析，无需倾斜样品台，直接可视化了包含复合物I、III和IV的呼吸超复合体。甲烷单加氧酶和氨单加氧酶的研究也表明，无需去垢剂提取，直接从膜中成像可获得高分辨率结构，揭示重要的蛋白质-脂质相互作用和去垢剂提取时观察不到的α螺旋。
脂质囊泡中膜蛋白的成像支持功能研究
Fred Sigworth在21世纪初认识到在脂质囊泡中研究膜蛋白的价值。囊泡中嵌入的膜蛋白其三维取向的自由度比在去垢剂胶束、两亲聚合物或脂质纳米盘中更少。此外，嵌入密封良好的囊泡中的膜蛋白可被施加跨膜离子或电压梯度，从而研究跨膜力对蛋白质构象的影响。虽然有多种方法可将膜蛋白重构到蛋白脂质体中，但过程通常需要大量定制，且成功重构的产率较低。然而，利用这种方法，已揭示了机械敏感性PIEZO1通道的力诱导构象变化、Eag Kv通道在电场下的电压传感器运动、以及跨膜电场如何通过调节PIP2结合位点来门控KCNQ1通道。对重构在线粒体复合物I蛋白脂质体中的冷冻电镜研究显示了缺血如何调节该复合物的活性。然而，这种方法通常需要过表达重组蛋白或极高丰度的内源性蛋白以获得足够样品，且去垢剂从天然膜中提取蛋白质时可能造成的破坏在重构前已然发生。
天然脂质囊泡中膜蛋白的成像可保存脆弱的相互作用
在某些特定膜中天然丰度很高的蛋白质系统，如哺乳动物大脑突触囊泡膜中的质子泵V型ATP酶（V-ATPase），为该方法提供了范例。对突触囊泡中V-ATPase的单颗粒冷冻电镜分析揭示，在天然囊泡膜环境中，V-ATPase以化学计量比与囊泡蛋白synaptophysin结合，而这种相互作用在用去垢剂从膜中提取酶时会丢失。使用特异性结合完整V-ATPase的细菌效应蛋白纯化囊泡，倾向于选择富含大量V-ATPase复合物的囊泡，有利于高分辨率结构分析和体外功能实验（如观察底物诱导的V1和VO解离）。而通过结合囊泡上其他蛋白（如vGlut1转运体）的纳米抗体纯化囊泡，则能更真实地反映囊泡组成，显示出相当一部分V-ATPase处于解离状态。这些观察表明，通过结构研究的目标蛋白本身来纯化囊泡有助于高分辨率结构测定，而通过囊泡中其他蛋白纯化则提供了更真实的组成快照。
可生成和分离用于结构分析的天然膜囊泡
研究内源性膜蛋白于其天然脂质双分子层中，并不总是要求它们在特定膜中高度富集。也可以通过将天然膜均质化成囊泡，然后富集含有目标蛋白的囊泡，再对制备物进行成像。原则上，这种方法可应用于任何膜蛋白，即使其在天然膜中丰度不高。已有研究成功应用于Mycobacterium smegmatis的胞质膜，获得了ATP合酶的低分辨率图谱和呼吸链复合物III2IV2超复合体的高分辨率图谱。后者的结构揭示了一个额外的结合蛋白，被鉴定为分枝杆菌克雷布斯循环中的苹果酸:醌氧化还原酶，该蛋白在去垢剂溶解的酶结构中不存在。对简化膜系统的研究还支持了停流光谱测量，证明了Mqo与呼吸链复合物III2IV2超复合体的相互作用实现了从苹果酸到超复合体的快速电子转移，这一现象只有在研究天然膜囊泡中的复合物时才能被发现。
研究结论与意义
研究表明，对源自其原生膜的脂质囊泡中的内源性膜蛋白进行成像，已被证明是一种高分辨率结构分析的有效方法。这种方法能够进行下游的功能研究，并保存了在去垢剂提取中会丢失的相互作用。当去垢剂提取不会破坏蛋白质-蛋白质相互作用，且功能实验无法从脂质双层的存在中受益时，在去垢剂中确定结构通常更简单、更快且能达到更高分辨率。尽管如此，针对膜蛋白在天然膜囊泡中冷冻电镜研究的挑战仍然存在，主要包括：（1）图像质量低，（2）囊泡产率低，（3）目标颗粒挑选困难，以及（4）缺乏专门的计算分析工具。囊泡成像对比度低是因为其需要较厚的冰层。此外，当蛋白质嵌入囊泡时，亲和基质对它的回收率通常低于用去垢剂从膜中提取时。天然膜通常拥挤着多种蛋白质，使得在囊泡图像中找到目标蛋白变得困难，且样品常被可溶性复合物（如核糖体）污染，这使颗粒挑选成为此类研究的主要挑战之一。计算上，脂质双层的信号可能主导图像对齐和分类，需要发展膜信号扣除或整合几何约束的方法。
尽管面临上述挑战，为内源性膜蛋白在其天然脂质双层中获得的三维结构实例数量稳步增加，证实了该方法的实用性。它可能无法展示蛋白质完全天然的环境，但它允许进行科学探索的一个重要方面：开展还原论实验，以探究结构与功能之间的关系。这种方法规避了重组表达和去垢剂提取带来的问题，使得研究人员能够在更接近生理状态的条件下解析膜蛋白结构，发现新的亚基和相互作用，并研究跨膜梯度等物理化学因素对蛋白功能的影响。这对于理解G蛋白偶联受体、离子通道、ATP合酶等关键膜蛋白的工作机制，以及针对这些靶点的药物设计，具有深远的意义，标志着结构生物学向更真实、更功能化的研究方向迈出了重要一步。
