《Birds》：Fecal Microbiota of the Yellow-Headed Blackbird (Xanthocephalus xanthocephalus) in Northern Mexico: An Ecological and One Health Perspective
Jorge Luis Cortinas-Salazar,
Cristina García-De la Pe?a,
Quetzaly K. Siller-Rodríguez,
Sergio I. Barraza-Guerrero,
Verónica ávila-Rodríguez,
Jesús Vásquez-Arroyo,
Juan Carlos Herrera-Salazar,
Luis M. Valenzuela-Nú?ez,
Juan Carlos Ontiveros-Chacón and
Dannia I. Orozco-López
+ 3 authors
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本研究首次揭示了墨西哥北部迁徙鸟类黄头黑鹂(Xanthocephalus xanthocephalus)的粪便微生物群组成。通过16S rRNA (V3-V4) 基因测序与保守筛查，发现其菌群以厚壁菌门_D(Firmicutes_D)、放线菌门(Actinobacteriota)和弯曲菌门(Campylobacterota)为主，具有高度多样性(1195个物种)。研究检测到极低丰度、曾有文献记载的潜在人畜共患病相关菌种(如粪肠球菌Enterococcus faecalis)，但认为该物种在自然条件下是环境微生物循环的指示者而非显著的人畜共患病风险源，为“一体化健康”(One Health)框架下的生态监测提供了重要基线。
1. 引言
肠道微生物群在鸟类的生理、营养和健康中扮演着核心角色。对于像黄头黑鹂(Xanthocephalus xanthocephalus)这样的迁徙性、高度群居的雀形目鸟类而言，其肠道菌群是研究宿主-微生物-环境相互作用的理想模型。这种鸟类在墨西哥北部的科马卡-拉古内拉地区越冬，频繁利用城市农业景观，其长距离迁徙和群居行为可能促进微生物在环境、物种和地区间的交换。然而，在此之前，黄头黑鹂的粪便微生物群仍未被充分表征。本研究旨在首次描述该物种在墨西哥北部的粪便细菌微生物群，并在“一体化健康”框架下，对初步鉴定到物种水平的细菌类群进行保守筛查，以评估其潜在的人畜共患相关性，从而将其解读为环境微生物动态的指示者，而非直接的人畜共患病威胁源。
2. 材料与方法
2.1. 研究区域
研究于2023年12月至2024年1月在墨西哥北部科马卡-拉古内拉地区（科阿韦拉州的托雷翁市，以及杜兰戈州的戈麦斯-帕拉西奥市和莱尔多市）的四个城市公园和绿地进行。该地区为半干旱暖温气候，采样点位于受城市基础设施和周边农业活动影响的环境中，是黄头黑鹂种群惯用的群栖地。
2.2. 粪便样本采集
采用非侵入性方法，在确认仅为黄头黑鹂栖息的树木下放置无菌纸袋，收集新鲜粪便。每个采样点汇集十处粪便沉积物作为一个混合样本，共获得4个混合样本。此举旨在获取栖息地水平的代表性微生物多样性。样本立即置于含裂解/稳定缓冲液的管中，低温运输并储存于-20°C直至处理。
2.3. 实验室工作
使用商业试剂盒提取细菌DNA。通过PCR扩增16S rRNA基因的V3-V4区域，所用通用引物为341F和806R。扩增产物在Illumina NovaSeq 6000平台上进行双端250 bp测序。本研究未包含提取空白和PCR阴性对照，此方法学局限性在结果解读时已被考虑。
2.4. 生物信息学分析
在QIIME2环境中使用DADA2流程对原始序列进行降噪，推断高分辨率的扩增子序列变体(ASVs)。使用基于Greengenes2数据库训练的朴素贝叶斯分类器进行物种分类。计算了观察到的ASVs、香农多样性(Shannon diversity)和皮卢均匀度(Pielou’s evenness)等α多样性指标。对于物种水平鉴定，采用了严格的BLAST+标准（E=0.0，序列同一性≥98%，查询覆盖率100%），但基于V3-V4区域的分类分辨率有限，因此物种水平鉴定被视为初步的，需谨慎解读。
2.5. 对初步鉴定细菌类群的保守筛查
对初步鉴定到物种水平的细菌类群进行了多步骤保守筛查。首先，依据已发表文献评估其是否为常见的试剂或皮肤相关污染物。其次，使用EFILTER工具注释其环境背景。未被标记为潜在污染物的类群，再与细菌-人类病原体数据库(BaHPD)等进行交叉比对，评估其已报道的人类致病性及人畜共患传播证据。整个框架旨在最大化生态可解释性，同时避免高估人畜共患相关性。
3. 结果
3.1. α多样性：细菌丰富度、丰度与均匀度
从四个混合样本中共获得3162个ASVs。测序深度充足，Good’s覆盖度值均为0.999。共鉴定出39个门、369个科、843个属和1195个细菌物种。其中211个具有有效拉丁双名法的类群经过了手动BLAST验证以支持其初步的物种水平鉴定。
在门水平，最优势的类群为厚壁菌门_D (平均相对丰度 38.56%)、放线菌门 (29.56%) 和弯曲菌门 (13.10%)。
在科水平，优势类群为支原体科(Mycoplasmoidaceae, 22.31%)、分枝杆菌科(Mycobacteriaceae, 22.28%) 和弯曲菌科(Campylobacteraceae, 9.05%)。
在属水平，最优势的类群为脲原体属(Ureaplasma, 22.09%)、棒状杆菌属(Corynebacterium, 19.83%) 和弯曲杆菌属_D(Campylobacter_D, 9.04%)。
α多样性指标在不同混合样本间存在差异，观察到的ASV丰富度介于558至1450之间，香农多样性值介于3.90至6.46之间，皮卢均匀度介于0.42至0.63之间。
3.2. 对初步鉴定类群的保守筛查及潜在人畜共患相关性
在211个初步鉴定到物种水平的细菌类群中，22个被归类为可能的污染物。在剩余的189个类群中，有35个在文献中被报道过在特定临床背景下可作为人类病原体。然而，其中仅有三个类群——粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens) 和艰难梭菌(Clostridioides difficile)——拥有记载的人畜共患传播证据。重要的是，这三者在所有样本中均以极低的相对丰度被检测到（均<0.007%）。
4. 讨论
4.1. 黄头黑鹂的粪便细菌
本研究首次全面描述了墨西哥北部黄头黑鹂的粪便细菌微生物群。检测到的高分类学丰富度反映了由环境暴露、饮食可塑性和该物种迁徙生态所塑造的复杂且动态的微生物群落。在门水平，厚壁菌门、放线菌门和弯曲菌门的优势与之前对鸟类的研究报告一致。脲原体属(Ureaplasma)在两个混合样本中呈现高相对丰度，该属在野生鸟类粪便中的生态意义仍有待阐明。混合样本间观察到的显著异质性可能反映了栖息地利用、局部觅食基质和微环境暴露的差异。
4.2. 粪便细菌的人畜共患和机会致病潜力
检测到的类群均不对应于鸟类适应性病原体或历史上与重大人畜共患病疫情相关的细菌物种。虽然有一小部分初步鉴定到物种水平的类群对应于临床数据库中报道的人类病原菌，但绝大多数缺乏动物传人传播的证据。仅有三个拥有文献记载人畜共患传播证据的类群，且均以极低丰度存在。这一模式表明，粪便微生物群中存在临床相关类群并不一定意味着流行病学风险。这些发现与近期研究一致，即迁徙鸟类通常是环境获得性微生物的短暂携带者，而非人畜共患病原体的稳定储存库。从“一体化健康”视角看，黄头黑鹂的粪便微生物群主要充当环境微生物动态的指示者，而非人畜共患威胁的来源。
4.3. 方法学范围与未来方向
本研究采用的非侵入性采样方法适合获取高质量细菌DNA，同时最大限度地减少对鸟类的干扰。从方法学角度看，将高通量测序与保守的分类学验证和生态导向的筛查相结合，能够对黄头黑鹂的粪便微生物群进行可靠的基线描述。该分析框架优先考虑对初步物种水平鉴定类群的谨慎解读，明确考虑环境和方法学干扰因素，并避免对低丰度类群的过度解读。
未来研究应通过跨迁徙周期的纵向采样来评估微生物群的时间动态，并比较不同栖息地，以区分环境与宿主相关的微生物特征。应用鸟枪法宏基因组学(shotgun metagenomics)可以直接评估功能基因和代谢潜能，而针对抗菌素耐药性(AMR)决定因素的特异性筛查则可以进一步明确迁徙鸟类微生物群的“一体化健康”意义。
5. 结论
本研究首次全面描述了墨西哥北部黄头黑鹂的粪便细菌微生物群，整合了分类组成、α多样性指标以及对潜在人畜共患关联的保守筛查。该鸟类的粪便微生物群高度多样化，反映了科马卡-拉古内拉地区城市-农业景观的特征、栖息地异质性以及社会性群居行为的综合影响。
尽管有三个初步鉴定到物种水平的类群曾被报道具有人畜共患潜力，但它们均以极低的相对丰度被检测到，且无一对应于鸟类适应性病原体或历史上与重大疫情相关的类群。这些发现表明在自然条件下公共卫生风险极低，并支持将迁徙性黑鹂解读为环境微生物循环的载体，而非人畜共患威胁的来源。重要的是，对低丰度、曾报道可能具人畜共患性的类群的检测应谨慎解读，因为存在于粪便材料中并不意味着宿主定植、微生物存活或传播潜力。
从“一体化健康”的角度来看，这项研究强调了自由生活的迁徙鸟类作为景观水平微生物动态哨兵的价值，反映了环境暴露和栖息地利用，而非活跃的疾病传播。尽管基于有限数量的混合样本，但这项工作为墨西哥的黄头黑鹂建立了首个微生物学基线。
