《Current Opinion in Chemical Biology》：Toward universal binder discovery: Advances in display, computational design and
in vivo platforms
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蛋白结合体发现技术综述：本文系统总结了体外展示平台（如噬菌体、酵母表面展示及mRNA显示）通过宏环化策略、共价化学和大数据分析优化筛选效率；计算设计借助AlphaFold和AI工具实现功能蛋白定向设计；并探讨体内定向进化技术（如基因编辑和自动化筛选）在提升结合体多样性和稳定性的潜力，指出多技术融合将推动生物医学研究进入高效模块化新阶段。
Jingzhou Yang|Eddy Pineda|Bryan C. Dickinson
芝加哥大学化学系，美国伊利诺伊州芝加哥市60637
蛋白质结合剂是化学生物学中的基本工具，是生物技术的关键组成部分，也是基于生物制剂的药物的基础。然而，目前还没有任何一种结合剂发现方法能够达到常规实验室使用所需的准确性、速度和成本效益。我们认为该领域正处于一个转折点。体外展示平台现在已经成熟，但通过大环化方法、共价化学和庞大的定量数据集不断进化——这不仅扩展了化学空间，还加深了对选择结果的机制理解。计算从头设计方法在过去几年中取得了巨大的进步，正从需要专业知识的工具转变为更易使用的平台。最后，体内定向进化技术正在成为一项关键的前沿技术，可能会带来实现结合剂发现民主化所需的吞吐量和准确性。这篇综述总结了这些进展，并指出了一个未来：结合剂的生成将变得快速、易于获取，并成为下一阶段生物研究的关键驱动力。
引言
蛋白质结合剂——能够以高亲和力和特异性识别特定目标的蛋白质——是生物医学研究和治疗开发中的基本工具。结合剂能够直接追踪生物分子[1]，并干扰信号网络，用于机制研究和靶向干预[2]。在治疗领域，蛋白质和肽类结合剂通过访问更广泛的表位空间来实现高特异性，并支持多特异性和药物偶联等模块化形式，从而超越单纯的抑制作用。这些优势激发了人们继续开发可扩展和通用结合剂发现平台的努力。
传统上，单克隆抗体的生产依赖于杂交瘤技术[3]：首先用目标抗原免疫小鼠以引发免疫反应，然后将分离出的B细胞与骨髓瘤细胞融合，创建永生的“杂交瘤”。这些克隆会分泌单克隆抗体，可以通过筛选来识别出与目标抗原具有高亲和力的结合剂。与此同时，体外展示技术作为一种强大的替代方案出现，克服了许多体内免疫方法的局限性[4]。这些系统利用各种介质（包括丝状噬菌体[5,6]、酵母表面展示[7,8]以及完全体外平台（如mRNA展示[9]或核糖体展示[10]）表达大量的变体库。通过反复的筛选和扩增过程，可以富集出能够高亲和力结合固定目标的变体。这两种方法都取得了巨大成功，共同产生了数百种获批或处于临床评估阶段的抗体疗法[11]，并在现代生物医学研究的几乎所有领域实现了分子层面的研究。
在过去五年中，蛋白质结构预测技术的快速发展（例如AlphaFold [12,13]和RoseTTAFold [14]等工具）推动了从头蛋白质结合剂计算设计的显著进步。这一获得诺贝尔奖认可的突破引发了结合剂发现领域的革命：曾经仅限于少数高度专业实验室的技术，现在通过用户友好的设计平台（如BindCraft [16]和BoltzGen [17]）变得易于使用，使研究人员能够直接在笔记本电脑上设计潜在的结合剂。这些进展，加上早期在噬菌体展示和定向进化方面的诺贝尔奖获奖工作，标志着结合剂发现发展的两个关键里程碑：建立了高多样性选择的实验基础，并将该领域推进到了计算时代。
在这篇综述中，我们重点介绍了正在重塑实验和计算领域中蛋白质结合剂发现的最新进展（图1）。我们首先探讨了基于展示平台的创新，这些创新通过大环化、共价化学和高通量筛选技术生成了大型数据集，有助于解析蛋白质-蛋白质相互作用和酶的机制。然后，我们评估了计算设计方法的迅速崛起及其如何加速了传统上具有挑战性的目标的结合剂发现。最后，我们介绍了新兴的体内选择和进化系统，这些系统提供了根本不同的结合剂发现途径，有望进一步加速发现工作流程并为生物技术的发展开辟新的途径。
部分摘录
大环化和共价性
噬菌体展示技术传统上使用抗体片段（scFv、Fab和VHH）[18]和线性肽[19]，可以生成大型库并高效富集高亲和力结合剂。最近，由于具有更好的稳定性和可调的生化特性，大环肽成为有吸引力的治疗形式[20,21]，而共价结合策略则实现了不可逆的抑制作用和持久的靶点占据[22]。Bogyo团队率先开发了大环肽技术第2节 - 蛋白质结合剂的计算设计
近年来，利用人工智能（AI）进行蛋白质结构预测和设计的平台得到了显著发展（图3b），主要得益于AlphaFold和RFdiffusion等平台[12,13,38]的推动。这些进步促进了计算蛋白质设计领域的重大繁荣，证明了准确从头设计功能性蛋白质和结合剂变得越来越可行。AlphaFold建立在结构生物学和蛋白质数据多年的研究基础上第3节 - 新兴的体内进化/选择技术
尽管基于展示和计算的方法在结合剂发现方面取得了变革性影响，但它们各自都存在固有的局限性。基于展示的选择方法通常需要大量的后续筛选才能区分真正的结合剂和非特异性的假阳性结果[32]。例如，在芯片上的核糖体展示中，只有3687个荧光激活细胞分选（FACS）富集的候选者中的53个和1479个磁激活细胞分选（MACS）富集的候选者中的47个表现出结合能力结论与未来展望
在这篇《Current Opinion》文章中，我们重点介绍了实验和计算方法在结合剂发现方面的最新进展。体外展示平台引入了创新的化学连接剂，引入了大环结构体和共价反应性，扩展了其在酶抑制和具有挑战性目标中的应用范围；同时，它们生成的大型数据集越来越多地用于解析新的蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）并训练机器学习模型。计算方法也在不断改进
利益冲突声明
作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：B.C.D.是描述split RNAP生物传感器的专利的发明人。芝加哥大学已为PANCS-Binders技术提交了临时专利，B.C.D.被列为发明人。
致谢
这项工作得到了美国国立卫生研究院国家普通医学科学研究所（GM119840项目）的支持。J. Yang感谢Edith Barnard纪念奖学金的资助。我们还要感谢S. Ahmadiantehrani在准备本文过程中提供的帮助。
