《Food Bioscience》：Mechanistic insights into sucrose-enhanced synthesis of medium chain fatty acid esters in pear wine: From gene expression and enzyme characterization to olfactory receptor interactions
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本研究系统解析外源蔗糖对梨酒香气品质的调控机制。发现蔗糖显著促进挥发性MCFAEs（如heptanol、ethyl caproate）合成，相关基因（PDC、ADH、ACC1等）及关键酶（EHT1p、EEB1p）活性受温度（30/45℃）和pH（7.5/8.0）调控，且MCFAEs与人类嗅觉受体OR4强结合。为果酒香气优化提供理论支持。
作者：燕子茹（Ziru Yan）、宋飞（Fei Song）、赵江丽（Jiangli Zhao）、李东妮（Dongni Li）、关俊峰（Junfeng Guan）、李晨（Chen Li）、李东瑶（Dongyao Li）、田洪涛（Hongtao Tian）
河北农业大学食品科学与技术学院，中国保定071000
摘要
果酒通常存在香气不足且不稳定的缺点。梨酒的特征香气化合物及其生物合成机制尚未得到充分了解，这限制了提高香气质量的努力。本研究分析了蔗糖对挥发性中链脂肪酸酯（MCFAEs）生物合成的影响，探讨了关键酶的酶学性质和催化过程，以及香气化合物与人类嗅觉受体之间的相互作用。研究发现，蔗糖促进了庚醇、乙基己酸酯、乙基辛酸酯和甲基癸酸酯等MCFAEs的合成。参与生物合成途径的基因（PDC、ADH、ACC1、FAS1、EHT1、EEB1、ACS1和ATF1）的表达上调。关键酶EHT1p和EEB1p在高温（30°C和45°C）和碱性条件（pH 7.5和8.0）下活性更高，其中EHT1p偏好辛酰-CoA，而EEB1p偏好癸酰-CoA。此外，鉴定出的特征香气化合物对嗅觉受体consOR4具有很强的结合亲和力。这些发现为理解果酒香气的机制和优化策略提供了全面的认识。
引言
香气是反映果酒质量的关键指标，也是影响消费者购买决策的重要因素。酯类化合物占果酒成分的最大比例，其含量和组成决定了果酒的风格。酯类的含量受多种因素影响，如原材料（品种和栽培方式）（Eden等人，2001；García-Izquierdo等人，2024；Pretorius，2019；Xi等人，2011；L. Zhang等人，2023）、微生物菌株（酵母和乳酸菌）（Benito等人，2019；Hu等人，2022；Lu等人，2015；Raymond Eder等人，2025）以及酿造工艺（预处理、温度、陈化）（P. Liu等人，2018；Massera等人，2021；Yu等人，2020）。虽然已有大量关于果酒香气的研究成果，但关于发酵菌株的香气产生特性和酯类合成机制的报道较少。
糖是水果中的关键营养素和风味成分，是发酵过程中微生物生长和代谢的主要能量来源，在果酒的风味特征中起着决定性作用（Jord?o等人，2015）。对于非葡萄果酒，添加糖是一种调整酒精含量和风味的常规方法。糖的类型、含量和添加方式会影响果酒的口感、香气和颜色。在蔗糖组、葡萄糖组、果糖组和麦芽糖组中，总酯类含量依次降低（Xie等人，2016）。葡萄糖与2,3-丁二醇、乙酸乙酯、乙基庚酸酯、乙基9-索莱诺酸酯和柠檬烯相关；果糖与糖醇、苯乙醇和苯乙醇相关；蔗糖与正己醇、异戊基乙酸酯、乙基辛酸酯、甲基癸酸酯、乙基癸酸酯和甲基水杨酸酯相关；麦芽糖与3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、乙基丁酸酯、乙基己酸酯、乙基十六酸酯、2-辛酮、甲基庚酮和辛酸等相关。这些物质赋予果酒花香、果香、草本香和甜味等感官特征（Z. Xu等人，2017；Y. Zhang等人，2017）。尽管蔗糖是常用的添加糖，但其调节酯类合成的分子机制，尤其是其对基因和关键酶的影响，尚未得到系统研究。
挥发性酯类的生物合成主要依赖于酵母细胞内的两种关键酶：酒精乙酰转移酶（alcohol acetyltransferase）和酒精氧酰转移酶（alcohol oxyacyltransferase）。酒精乙酰转移酶催化底物乙酰-CoA与乙醇或更高醇类之间的乙酸酯形成，其中乙酰-CoA来源于丙酮酸的氧化脱羧反应，而更高醇类则来源于氨基酸代谢（Mason等人，2000）。该酶的编码基因为ATF1、ATF2和Lg-ATF1，其调控机制受到了广泛关注。40%的乙酸乙酯和80%的异戊基乙酸酯的合成与ATF1相关；调节ATF1的表达可以显著改变乙酸酯的产量（Lilly等人，2006；Verstrepen等人，2004）。酒精氧酰转移酶催化短链或中链脂肪酸与乙醇之间的乙酸酯形成，脂肪酸通过脂肪酸合成酶复合体以不同链长的酰基-CoA形式合成和释放（Marchesini等人，2003）。该酶的编码基因为EHT1和EEB1，其中EHT1主要合成乙基己酸酯，EEB1合成其余的中链乙酸酯（Saerens等人，2006）。关于乙酸酯合成的现有研究结论存在争议。一些研究表明Eht1p和Eeb1p影响乙基己酸酯、乙基辛酸酯和乙基癸酸酯的生成，EHT1和EEB1基因的过表达可增加中链乙酸酯的含量（Chen等人，2014；Knight等人，2014；Li等人，2014；Lilly等人，2006；Takahashi等人，2017；Yin等人，2019）。然而也有研究表明EHT1和EEB1并非乙酸酯合成的限速酶，这些基因的过表达不会增加乙酸酯的含量（Saerens等人，2006）。有观点认为乙酸酯的含量取决于底物浓度而非酶的催化作用。此外，适当的低温不仅有利于酒精发酵的缓慢而彻底进行，还影响参与酯类合成的酶的活性（Chen等人，2014；Dzialo等人，2017）。在高氧条件下，乙酰-CoA的可用性降低，不利于酯类的合成（J. Liu等人，2016）。这种矛盾凸显了我们对EHT1p和EEB1p的底物选择性、酶学性质和代谢调控网络的了解不足。
本研究基于以下假设：在高蔗糖发酵环境中，EHT1p和EEB1p的活性不仅是由底物驱动的被动反应，还是Saccharomyces cerevisiae为应对碳源过剩和渗透压压力而进行的主动代谢活动。诱导EHT1p和EEB1p的表达可将多余的酰基-CoA转化为中链脂肪酸酯（MCFAEs），这些酯类可发挥多种生理作用，如解毒（消耗多余的酰基-CoA）和能量储存（以酯的形式储存碳源），从而维持细胞稳态。因此，分析这两种酶的生物信息学特性和酶学性质不仅有助于解释它们合成特定香气化合物的能力，还能说明酵母如何调节酶的功能以实现代谢稳态，从而适应发酵环境中的压力。
此外，酯类的最终感官效应不仅取决于其合成和释放，还取决于它们与人类嗅觉受体的相互作用。近年来关于人类嗅觉蛋白及其气味感知机制的研究逐渐增多（Billesb?lle等人，2023；De March等人，2024）。从分子合成到感官感知的完整过程仍有待阐明。
本文旨在通过多维度整合策略系统分析外源蔗糖对梨酒香气质量的调控机制。首先，研究了蔗糖对梨酒香气谱的影响；其次，从基因表达和蛋白质功能层面揭示了蔗糖对MCFAEs合成途径的调控作用，并阐明了关键酶EHT1p和EEB1p的酶学性质；最后，通过模拟酶-底物催化和香气-受体识别过程，从分子相互作用的角度探讨了催化机制和感官功能基础。该研究为通过合理调控提高果酒香气质量提供了理论依据。
实验材料与试剂
Saccharomyces cerevisiae（如9X3、11Y8、11H1、11H8、7H3、11X8、11Y3、11H3、11X10、11Y2）、Pichia Pastoris GS115及克隆载体pPIC9K均保存于实验室。PerfectStart? Green qPCR SuperMix购自北京TransGen Biotech有限公司；NotI和AvrII购自大连Takara Bio有限公司；硫酸卡那霉素、YNB培养基等购自北京Solarbio科技有限公司；受体细胞DH5a购自北京Biomed Gene科技有限公司
外源蔗糖对发酵香气的影响
Saccharomyces cerevisiae 9X3、11Y8和7H3的酶活性较高，三者之间无显著差异。然而，这些菌株的酶活性显著高于11Y3和11H3菌株（图S1A）。添加蔗糖的梨汁使用9X3菌株进行发酵，可生产出酒精含量和酸度平衡的高品质梨酒（图S1B–1F）。发酵结束时（7天），蔗糖增加了挥发性醇类的含量
结论
添加外源蔗糖显著提高了梨酒中庚醇、乙基己酸酯、乙基辛酸酯和甲基癸酸酯的含量，超过了感官阈值，从而提升了果酒的感官品质。蔗糖有利于MCFAEs的生成，参与该合成途径的基因PDC、ADH、ACC1、FAS1、EHT1、EEB1、ACS1和ATF1的表达上调，而ALD6的表达下调。从中鉴定出EHT1p和EEB1p
作者贡献声明
李东妮（Dongni Li）： 数据整理。
赵江丽（Jiangli Zhao）： 方法学。
宋飞（Fei Song）： 软件开发。
燕子茹（Ziru Yan）： 文稿撰写——初稿、软件使用、方法学设计、数据整理。
田洪涛（Hongtao Tian）： 资源获取、资金申请。
李东瑶（Dongyao Li）： 文稿审阅与编辑、监督。
李晨（Chen Li）： 监督、实验设计。
关俊峰（Junfeng Guan）： 资源支持。
未引用参考文献
Marchesini和Poirier，2003；Mason和Dufour，2000；Silvestrini和Cianci，2020；Xu和Liu，2017。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
