食品级二氧化钛（TiO?）与TDCPP的联合暴露会干扰ACOD1/伊塔康酸（Itaconate）的代谢途径，并导致小胶质细胞中TET2-NF-κB信号通路的激活，从而加剧神经毒性

本研究探讨食品级二氧化钛（TiO2）与磷酸三苯酯（TDCPP）共同暴露对神经系统的毒性机制。通过星形胶质细胞、小胶质细胞和神经元细胞模型，发现共同暴露显著激活BV2小胶质细胞，通过抑制Acod1/itaconate代谢轴和NF-κB信号通路，导致Tet2去甲基酶活性升高，促炎因子（Il-6、Il-1β、Tnf-α）表达上调，最终通过微胶质炎症间接引发Neuro-2a神经元凋亡。研究揭示了纳米级TiO2作为复合污染物载体的潜在机制，为儿童神经发育毒性评估提供新模型。

　　

郭晴|王对娟|赵长宁|魏世荣|胡晨翰|刘泽成|李颖|李瑞|王金强

中国湖北省医科大学公共卫生学院南水北调水源区环境与健康研究中心，十堰442000

摘要

食品级二氧化钛（TiO2）和三（1,3-二氯-2-丙基）磷酸酯（TDCPP）是环境中常见的污染物，儿童接触这些物质的风险较高，可能对神经发育造成潜在危害。然而，它们共同作用时的神经毒性仍知之甚少。在本研究中，我们使用C8-D1A星形胶质细胞、BV2小胶质细胞和Neuro-2a神经母细胞瘤细胞来探讨食品级TiO2和TDCPP共同暴露的神经毒性。毒性实验表明，这两种物质共同作用对BV2细胞的影响最为显著。进一步的共培养实验证实，这种共同暴露主要通过激活BV2细胞间接加剧了Neuro-2a神经元的凋亡。转录组学和RT-qPCR分析显示，BV2细胞中aconitate脱羧酶1（Acod1）基因表达下调，而促炎细胞因子（Il-6、Il-1β和Tnf-α）以及DNA去甲基化酶Tet2表达上调。通过Acod1基因敲低、外源性itaconate干预和共培养实验验证，食品级TiO2和TDCPP的共同暴露抑制了Acod1/itaconate轴，并与TET2活性升高和NF-κB激活相关。这些变化与小胶质细胞的炎症反应和神经元凋亡有关，提示可能存在表观遗传学机制。我们的结果揭示了食品级TiO2和TDCPP共同毒性的新机制，并表明itaconate在减轻神经炎症方面具有治疗潜力。

引言

食品级二氧化钛（TiO2）是一种常见的食品添加剂，广泛用于儿童喜爱的加工食品中，包括口香糖、果酱、巧克力、腌梅、果冻、蛋糕、膨化零食和牙膏¹。由于饮食偏好，儿童每天摄入的TiO2量显著高于成人（0.05-10 mg/kg，大约是成人的2-4倍）^{2, 3, 4}。值得注意的是，食品级TiO2的粒径分布广泛，其中34.7%-55.6%的颗粒为纳米级（<100 nm）^{5, 6}。由于颗粒体积小，这些纳米颗粒可能穿过血脑屏障并在大脑中积累⁷，从而可能引起神经元损伤或功能障碍^{8, 9}。此外，二氧化钛纳米颗粒（TiO2 NPs）具有高表面积和表面反应性等独特理化性质，能够吸附环境中的有机污染物并形成复合污染物^{10, 11, 12, 13}，这可能增强其生物毒性。儿童正处于大脑发育的关键阶段，血脑屏障功能尚未成熟，使其神经系统对外部刺激特别敏感^{14, 15}。然而，关于食品级TiO2与其他高暴露风险有机污染物共同作用的神经毒性研究仍有限。因此，研究食品级TiO2与其他环境污染物共同暴露的神经毒性对于食品安全风险评估和公共卫生政策制定至关重要。尽管现有研究表明食品级TiO2可能具有神经毒性，但目前的研究主要集中在工程化纳米TiO2上^{16, 17}，其在实际环境暴露背景下的确切机制仍不清楚。

有机磷酸酯阻燃剂三（1,3-二氯-2-丙基）磷酸酯（TDCPP）作为多溴联苯醚的替代品，广泛应用于塑料、家具、纺织品、电子设备和儿童产品中¹⁸。其广泛应用导致儿童接触风险显著增加，使其成为这一群体中高暴露风险的阻燃剂。研究表明，婴儿（2-18个月大）尿液样本中TDCPP代谢物的检出率超过93%，且暴露水平远高于成人¹⁹。研究证实，新生儿接触TDCPP可通过小胶质细胞介导的神经炎症途径引起神经元损伤²⁰。重要的是，TiO2 NPs具有强表面吸附性，可能通过与环境中的TDCPP相互作用形成复合污染物²¹。儿童通过饮食接触食品级TiO2，通过消费品接触TDCPP。因此，迫切需要评估它们的共同神经发育毒性。

目前关于工程化TiO2 NPs和TDCPP神经毒性的研究主要集中在它们对神经元的直接影响上。例如，研究发现TiO2 NPs会在大鼠海马神经元中积累，抑制GAP-43表达并诱导氧化应激，从而干扰轴突发育和神经网络形成²²。类似地，Li等人发现60μM的TDCPP会上调

分化后的PC12细胞中的DDIT4表达，抑制mTOR磷酸化，激活由Beclin-1/LC3II介导的自噬，最终引发神经元凋亡和功能障碍²³。然而，大脑是一个由神经元和胶质细胞组成的复杂网络系统²⁴。近年来的研究强调了神经元-胶质细胞相互作用在大脑发育、神经可塑性和神经退行性疾病中的关键作用²⁵。例如，Soelter TM等人的研究表明，阿尔茨海默病患者的胶质细胞可以激活特定转录因子，上调WNT、p53和NF-κB等信号通路，从而导致神经元损伤²⁶。值得注意的是，靶向调节胶质细胞功能已被证明可以有效保护神经元并改善认知功能²⁷。尽管研究表明工程化TiO2 NPs更容易被小胶质细胞吸收并通过胶质细胞间接损伤神经元²⁸，但这种机制是否适用于具有不同理化性质的食品级TiO2尚不清楚。因此，这种间接神经毒性的潜在机制仍不明确。

基于这些研究背景，本研究探讨了在理论上的高暴露参考浓度下食品级TiO2与TDCPP以及亚毒性暴露剂量下TDCPP共同暴露是否通过破坏胶质细胞-神经元相互作用加剧神经毒性。结果表明，这种共同暴露对小鼠小胶质细胞系（BV2）的影响最为显著，并通过激活小胶质细胞间接加重小鼠神经母细胞瘤细胞系（Neuro-2a）的凋亡。通过整合转录组学、Acod1基因敲低和外源性itaconate干预方法，我们发现这种共同暴露抑制了Acod1/itaconate轴，增加了NF-κB启动子的去甲基化，从而激活了小胶质细胞的炎症反应，最终导致神经元凋亡加剧。这些发现不仅确定了Acod1/itaconate-TET2-NF-κB轴作为调控小胶质细胞炎症中的代谢-表观遗传-免疫相互作用的核心机制，为风险评估提供了新的见解。更重要的是，通过使用理论上的高暴露参考浓度的食品级TiO2和亚毒性剂量的TDCPP，本研究揭示了一种载体介导的跨细胞神经毒性机制，为评估实际暴露风险建立了新的实验模型。

实验部分

二氧化钛纳米颗粒悬浮液的制备

使用分析天平精确称量6毫克的食品级TiO2，将其悬浮在7.5毫升1×10^-2摩尔/升的硝酸溶液中。在冰浴条件下，以40%的功率用探针超声处理20分钟以确保完全分散。随后加入2.5毫升3.2克/升的牛血清白蛋白溶液，剧烈涡旋混合1分钟以稳定纳米颗粒，得到TiO2浓度为600微克的储备溶液。通过调整pH值至7.0

二氧化钛的特性

本研究中使用的食品级TiO2呈非晶结构，近乎球形（图1 A）。TEM分析显示主要粒径分布如下：55.2%的颗粒直径小于100纳米，44.8%的颗粒直径在100-300纳米之间。平均粒径为98.3 ± 42.5纳米（图1 b）。这一粒径分布与He等人的研究结果一致⁶。XRD分析进一步证实了这一点

讨论

研究表明，大约19%-39%的食品级TiO2颗粒属于纳米级（<100纳米）⁶。本研究使用DLS和TEM对食品级TiO2颗粒进行了表征。粒径分布如下：50-100纳米（50.39%），100-150纳米（29.98%），150-200纳米（9.09%），200-250纳米（2.07%）。这一分布与典型暴露情况下食品级TiO2颗粒的粒径谱一致^{33, 34}（图1 A-D）。

结论

本研究系统地探讨了食品级TiO2和有机磷酸酯阻燃剂TDCPP对胶质细胞和神经元的共同神经毒性及其潜在的相互作用机制。研究发现，食品添加剂TiO2和TDCPP的共同暴露对BV2小胶质细胞的毒性最为显著，并通过激活小胶质细胞间接加剧Neuro-2a神经元的凋亡。通过整合转录组分析、Acod1

作者贡献声明

王对娟：研究、数据分析、数据管理。赵长宁：研究、数据分析、数据管理。郭晴：写作——审稿与编辑、初稿撰写、资源获取、研究、资金筹集、数据分析、概念构思。王金强：写作——审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构思。李颖：写作——审稿与编辑、资金筹集。李瑞：写作——审稿与编辑、项目

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本工作得到了中国湖北省自然科学基金（项目编号2025AFB112）、湖北医科大学青年学者培养项目（项目编号2022QDJZR011；2022QDJZR012）、湖北省高等教育优势学科群（公共卫生）项目（2021–2025年，项目编号2022PHXKQ2）以及湖北医科大学临床营养学科建设项目（项目编号X1203625）和国家自然科学基金的支持