《Food Control》：Development of fluorescence and colorimetric LAMP-based assays for rapid and sensitive detection of toxigenic
Bacillus cereus group strains in plant-based products
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为解决植物性食品中蜡样芽孢杆菌产毒风险快速检测的难题，本研究成功开发了靶向其关键致吐（cesA）和产肠毒素（hblD, nheB, cytK-1）基因的LAMP检测方法。该系列方法特异性强、灵敏度高，在人工加标和市售产品验证中均表现出色。其中，比色LAMP可作为现场快速初筛工具，结合荧光qLAMP对可疑结果进行确认，为保障新兴植物性食品的微生物安全提供了一套高效、实用的检测方案。
随着素食主义和环保意识的兴起，以植物蛋白为基础的各类食品，如植物奶、素肉、素食奶酪等，正以前所未有的速度走向我们的餐桌。然而，这些看似更健康、更可持续的食品，也并非微生物风险的“避风港”。其中，蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）及其“近亲”们组成的蜡样芽孢杆菌群，就是一个需要警惕的“隐形威胁”。这类细菌在自然界中广泛存在，尤其与土壤和植物关系密切，它们能形成耐热的芽孢，即使经过常规的巴氏杀菌或高温处理也可能存活下来。更麻烦的是，其中一些菌株携带“毒素武器库”，可产生导致呕吐的致吐毒素（由ces基因簇编码）或引发腹泻的肠毒素（如hbl、nhe、cytK-1等），是食源性疾病爆发的重要原因之一。近年来，已有研究在植物性肉类替代品和饮料中检出这类细菌，甚至出现了与植物奶相关的蜡样芽孢杆菌中毒爆发事件，这为新兴植物性食品产业敲响了安全警钟。
传统的微生物检测方法耗时漫长，而主流的分子检测技术如PCR，虽灵敏特异，但需要昂贵的仪器和专业操作，难以满足食品生产企业现场快速筛查的需求。有没有一种方法，既能像PCR一样精准锁定目标毒素基因，又能像pH试纸一样简单直观地读取结果，方便在工厂、仓库甚至市场现场快速做出判断呢？这正是发表在食品科学领域权威期刊《Food Control》上的这项研究试图回答的问题。意大利圣心天主教大学等机构的研究团队，成功开发并验证了一套基于环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）技术的快速检测“组合拳”，专门用于筛查植物性食品中产毒蜡样芽孢杆菌的“犯罪基因”。
为了达成目标，研究人员主要运用了几项关键技术：首先是针对四个关键毒素基因（hblD, nheB, cytK-1, cesA）进行LAMP引物设计与筛选（其中nheB引物引用自文献，其余为新设计）；其次，利用实时荧光定量PCR仪对LAMP反应条件（温度、时间）进行系统优化，并评估其分析灵敏度与特异性；接着，建立了基于酚红指示剂的比色LAMP检测方法，实现了肉眼判读结果（黄色为阳性，粉色为阴性，橙色为可疑）；然后，将方法应用于四种代表性植物性基质（豆奶、豌豆汉堡、覆盆子糖浆、草药片）的人工加标样本，验证其在复杂食品基质中的检测能力；最后，使用该比色方法对72种市售植物性产品（包括饮料、肉/鱼类似物、奶酪/蛋类似物、素食面食和膳食补充剂）进行了大规模筛查，并对产生可疑（橙色）信号的样本，采用延长反应时间的荧光qLAMP进行确认。
3.1. 引物选择
研究最初为每个靶基因设计了两套引物，但只有针对hblD、cytK-1和cesA基因的三套新设计引物在初步评估中表现出成功的扩增，具有强荧光信号、平滑的S型扩增曲线和单一锐利的熔解曲线峰，显示出高效和可靠，因此被采纳。此外，研究还引入了一套已发表的靶向nheB基因的LAMP引物。这四套引物构成了本研究的核心检测工具。
3.2. LAMP反应条件的优化与灵敏度
通过对温度梯度（62-66°C）的测试，确定65°C为所有四个引物组的最佳反应温度。在最佳条件下，hblD、cesA和cytK-1 assays的检测限低至10 fg/μL（每反应），而nheB assay的检测限在0.1至1 pg/μL之间。比色LAMP的结果与荧光检测一致，在相应检测限浓度下呈现明显的黄色（阳性），在更低浓度时呈现橙色（可疑），证明了其作为快速筛查工具的可行性。
3.3. LAMP检测的特异性
使用包含27株芽孢杆菌（其中18株属于蜡样芽孢杆菌群）和18株非芽孢杆菌食源性病原菌在内的45株菌株进行特异性测试。结果显示，所有引物组对非芽孢杆菌均无扩增。hblD、nheB和cytK-1 assays与参考的终点PCR结果完全一致，显示出100%的特异性。而cesA assay产生了一例假阳性结果（一株经终点PCR确认为阴性的菌株出现了扩增），但其对阳性菌株的检出灵敏度为100%。比色检测结果与荧光结果的特异性模式一致。
3.4. 人工污染产品的分析
在四种植物性产品（豆奶、豌豆汉堡、覆盆子糖浆、草药片）中人工添加蜡样芽孢杆菌芽孢，污染水平从101到 105spores × mL-1(或 g-1)。qLAMP分析证实，在所有污染水平和所有食品基质中，均能成功检测到hblD和nheB基因（因接种菌株只携带这两个基因）。检测时间与孢子浓度呈反比。比色分析在较高污染水平（103到 105spores × mL-1）下显示明确的黄色阳性，在低水平污染时出现橙色信号，与荧光结果吻合。
3.5. 市售植物性产品中蜡样芽孢杆菌毒素基因存在情况的评估
对72种市售植物性产品的筛查显示，30个样本对至少一个毒力基因呈阳性。nheB基因的检出率最高（32%的确认为阳性），其次是hblD（15%）、cytK-1（13%）和cesA（7%）。值得注意的是，相当一部分样本产生了可疑的橙色信号，尤其是在cesA（24%）和cytK-1（22%）检测中。对这些可疑样本进行延长时间的qLAMP确认后发现，其中一部分（因靶基因不同，确认比例在10%到42%之间）为真正的低水平阳性，其余则无扩增。产品“Chicken_fillets_pea”同时检出全部四个靶基因，是毒力基因负荷最高的样本。
研究的结论与讨论部分，强调了所开发的多重LAMP检测体系的重要意义。首先，该方法成功填补了针对新兴、异质性强的植物性食品基质中，快速检测蜡样芽孢杆菌关键毒力基因的技术空白。与之前多数只针对单个基因（如nheB或ces）的LAMP研究相比，本研究同步靶向四个主要致吐和产肠毒素决定因子，能更全面地评估菌株的产毒潜力，降低了因依赖单一遗传标记而导致假阴性的风险。
其次，研究建立的两步式工作流程极具应用价值：比色LAMP凭借其设备需求低、结果肉眼可视（黄-粉颜色变化）的优点，非常适合作为食品企业和监管机构进行现场一线筛查的“快检工具”；而当出现难以判读的橙色等可疑结果时，则可用更精准的荧光qLAMP进行确认。这种组合兼顾了速度、成本与准确性。
再者，对市售产品的筛查结果证实，植物性食品，尤其是大豆蛋白基的产品和草药膳食补充剂，确实存在不容忽视的蜡样芽孢杆菌群污染，且产肠毒素基因（nheB, hblD）的流行率显著高于致吐基因（cesA），这与以往在其他食品中的调查趋势一致。研究也客观分析了方法的局限性，例如cesA assay出现的一例假阳性，可能与LAMP技术本身灵敏度极高，或ces基因所在的质粒区域存在同源序列有关，未来可通过优化引物或采用探针法LAMP来提升特异性。
此外，研究深入探讨了植物性基质本身对比色结果可能产生的干扰。产品中复杂的化学成分（如有机酸、多酚、色素）、高缓冲能力（特别是高蛋白的豆制品），以及加工过程（如超高温灭菌、挤压）可能导致DNA碎片化或释放抑制物，这些都可能影响扩增效率，导致颜色转变不完全，产生橙色“可疑”信号。这恰恰说明了荧光确认步骤的必要性。
最后，作者明确指出，检测到毒素基因并不等同于存在即时的食品安全风险，因为毒素表达还受菌株特异性调控和环境影响。因此，该方法应被视为一种高效的“预筛查”工具，用于识别潜在的产毒风险样本，阳性结果可进一步用传统方法验证活性毒素的存在。总体而言，这项研究开发的LAMP检测组合为保障快速增长的植物性食品产业的微生物安全，提供了一套灵敏、快速且有望现场实施的强大技术方案，是该领域方法学上的一项重要进展。
