《Food Microbiology》：N'-(4-fluorophenyl)-2-pyridinecarbohydrazide targets succinate dehydrogenase to control citrus blue mold
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本研究合成3个含4-氟苯基的吡啶甲酰肼衍生物（2-FPH、3-FPH、4-FPH），发现2-FPH对丙二酸单酰辅酶A还原酶（SDH）具有显著抑制作用，MIC 12.5 μg/mL，MFC 25 μg/mL，其抗真菌机制涉及细胞膜通透性增加、线粒体功能紊乱及ROS水平升高，且生物安全性优于传统杀菌剂丙氯拉津。
高亮亮|李腾杰|熊增荣|尤明楠|张军|陶能国
湘潭大学化学工程学院，中国湘潭411105
摘要
本研究设计并合成了N'-(4-氟苯基)-2-吡啶碳酰肼（2-FPH）、N'-(4-氟苯基)-3-吡啶碳酰肼（3-FPH）和N'-(4-氟苯基)-4-吡啶碳酰肼（4-FPH），这些化合物对耐丙氯唑的Penicillium italicum菌株（PiR2）表现出显著的抗真菌活性。其中，2-FPH对PiR2生长的抑制作用最强，最低抑菌浓度（MIC）为12.5 μg/mL，最低杀菌浓度（MFC）为25 μg/mL。体内抗真菌和溶血毒性测试表明，2-FPH能有效防止柑橘果实受到PiR2的感染，同时具有极低的溶血毒性。在相同浓度下，其生物安全性和控制效果远优于丙氯唑。根据形态学观察，2-FPH增加了细胞膜的通透性，导致细胞肿胀和形态异常，破坏了细胞壁的结构完整性，并降低了几丁质含量。生理学、生物化学和分子生物学研究表明，2-FPH与琥珀酸脱氢酶（SDH）结合，抑制其酶活性并抑制相关基因的表达，从而降低细胞内ATP水平，破坏线粒体功能，并引发活性氧（ROS）的显著增加。总之，2-FPH作为可能的杀菌剂和琥珀酸脱氢酶抑制剂，在防治柑橘蓝霉病方面显示出广阔的应用前景。
引言
柑橘是全球产量最高的果树之一，因其独特的风味和高营养价值而受到消费者的喜爱（Chen等，2023；Wang等，2025）。在中国，新鲜柑橘产业具有巨大潜力，是国家水果消费的重要组成部分。然而，Penicillium italicum和P. digitatum引起的病害严重威胁了新鲜柑橘的供应和经济效益（Moraes Bazioli等，2019；Zhang等，2022）。据报道，这两种采后病害每年导致近25%的新鲜水果腐烂，造成重大经济损失（Bhatta，2022）。常用的化学防治剂如咪唑菌胺和丙氯唑（14α-甾醇脱甲基酶抑制剂，DMI）仍是控制这些病害的最经济方法（Zhang等，2023）。然而，过度使用杀菌剂导致病原真菌产生抗药性，危及农产品的安全性（Niu等，2018；Zhang等，2023）。
耐丙氯唑的P. italicum菌株在全球主要柑橘种植区广泛存在，大大降低了丙氯唑的防治效果，使得柑橘采后病害的控制变得极为困难（Erasmus等，2015；Moussa等，2020）。在我们之前的研究中，从中国湖南省的柑橘种植区分离出了两种对丙氯唑高度耐药的P. italicum菌株（PiR2和PiR4），它们的EC50值分别为38.27 μg/mL和25.01 μg/mL，即使在400 μg/mL浓度下其菌丝生长也未受影响。初步的机制研究表明，CYP51B基因突变可能与这种抗性有关（Li等，2026）。因此，开发创新且低风险的杀菌剂是应对这些挑战的主要策略，无论是为了实现柑橘产业的可持续发展目标，还是为了满足公众对食品安全和质量的更高要求。
天然产物在制药和农药开发中具有重要作用，由于其独特的化学结构、多样的生物来源和良好的环境兼容性，为保护人类健康和推进可持续农业做出了重要贡献（Aldholmi等，2019；Chen等，2025）。尼古酸是一种存在于动植物中的重要化合物，参与多种基本代谢途径（Ahmad等，2021）。其分子结构包含一个易于修饰的羧基和一个吸电子的吡啶环，使其及其异构体（如吡啶甲酸和异烟酸）成为基于吡啶的药物设计的关键骨架（Nizamov等，2019；Yousef等，2019；Yu等，2021）。肼结构被广泛用于构建各种生物活性分子，在制药和农药中展现出良好的生物活性，如抗菌和抗癌作用（Chang等，2023；Murugappan等，2024；Teng等，2024）。最新研究表明，将肼结构与天然产物或其衍生物（如孜然酸、香叶醛和麦芽醇）结合，可以生成具有强抗真菌活性的化合物，有望开发成新的杀菌剂（Chen等，2025；Gong等，2025；Yang等，2024）。在之前的工作中，我们基于植物精油的分子结构合成了多种含肼的硫脲衍生物，这些化合物对P. digitatum和P. italicum表现出强烈的抗真菌活性（Li等，2026；Zhang等，2024）。因此，我们推测合成同时含有尼古酸（或其类似物）和肼基的化合物将产生针对耐丙氯唑P. italicum的新抗真菌剂。
因此，在本研究中，我们将尼古酸、异烟酸和吡啶甲酸与4-氟苯基肼反应，合成了三种N'-(4-氟苯基)-吡啶碳酰肼衍生物（2-FPH、3-FPH和4-FPH），并测试了它们对耐丙氯唑的P. italicum菌株（PiR2）的疗效。通过表型分析（碘化丙啶（PI）染色、荧光素二乙酸酯（FDA）染色、Calcofluor White（CFW）染色、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM））、生理和生化指标（活性氧（ROS）水平、线粒体膜电位（MMP）和琥珀酸脱氢酶（SDH）活性）以及分子水平（SDH相关基因表达分析和分子对接模拟）来探讨2-FPH的抗真菌机制。此外，还通过体内抗真菌疗效和溶血毒性测试评估了2-FPH的潜在应用价值和生物安全性。
化学试剂和生物材料
尼古酸（99%）、异烟酸（99%）、吡啶甲酸（99%）、N,N-二甲基甲酰胺（DMF，99.9%）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，99.9%）、2-(7-氮杂苯并三唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐（HATU，99.5%）、4-氟苯基肼盐酸盐（99%）、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH-DA，97%）、碘化丙啶（PI，98%）、荧光素二乙酸酯（FDA，97%）和氘代氯仿（CDCl3，99.8%）均购自Energy Chemical（中国上海）。
化合物合成
在基本反应条件下，使用HATU作为缩合剂，使吡啶羧酸的三种位置异构体（邻位、间位和对位）与4-氟苯基肼反应，分别生成了三种N'-(4-氟苯基)-吡啶碳酰肼衍生物（2-FPH、3-FPH和4-FPH），产率分别为70%、65%和32%。目标化合物的结构通过1H NMR、13C NMR和HRMS确认（图S1～9），具体数据见补充材料。
讨论
为应对日益严重的药物抗性问题，当前的研究策略集中在发现新型靶点杀菌剂上，同时强调生物安全性。2-FPH对耐药菌株（PiR2）和敏感菌株（PiS1）的MFC值均为25 μg/mL，MIC值分别为12.5 μg/mL。其对孢子萌发的EC50值为2.09 μg/mL，对菌丝生长的EC50值分别为2.17 μg/mL和5.24 μg/mL和4.08 μg/mL。2-FPH作为一种新型杀菌剂表现出巨大的潜力。
结论
本研究合成了三种酰肼衍生物（2-FPH、3-FPH和4-FPH），它们对耐丙氯唑的P. italicum（PiR2）具有很强的抗真菌活性。活性筛选显示，N'-(4-氟苯基)-2-吡啶碳酰肼（2-FPH）在体外和体内均显著抑制了PiR2菌株的生长。2-FPH在抑制效果和生物安全性方面均优于市售的丙氯唑杀菌剂。机制研究表明，该化合物作用于琥珀酸脱氢酶（SDH）。
CRediT作者贡献声明
熊增荣：可视化、软件、方法学、数据分析。尤明楠：可视化、软件、方法学。张军：监督、研究、数据分析。陶能国：监督、项目管理、方法学、资金获取、概念设计。高亮亮：写作——审稿与编辑、初稿撰写、可视化、软件、方法学、数据分析。李腾杰：初稿撰写、可视化、软件
未引用参考文献
Chen等，2025；Chen等，2025；Li等，2026；Li等，2026；Thamban Chandrika等，2023。
数据可用性
数据可应要求提供。
利益冲突声明
作者声明无利益冲突。
致谢
本研究得到了
国家自然科学基金（编号32372396）、湖南省研究生科学研究创新项目（编号CX20250988）和湘潭大学研究生科学研究创新项目（编号XDCX2025Y387）的支持。
