免疫荧光辅助技术用于研究人类星状病毒1型在牡蛎加工与生产过程中的传播情况

《Food Microbiology》：Immunofluorescence-assisted investigation of Human Astrovirus-1 in oyster processing and production

氯 dioxide、过醋酸、紫外-C对牡蛎及食品接触基质中astro病毒灭活效果评估与检测方法优化。

　　

宋惠元|韩尚哈|李孝彬|文妍仁|朴诗宏|哈尚铎

韩国京畿道安城市忠?大学食品安全与法规科学系，高级食品安全研究小组，邮编17546

摘要

本研究评估了二氧化氯（ClO₂）和过氧乙酸（PAA）作为化学消毒剂的抗病毒效果，以及UV-C辐照作为物理处理方法对HAstV-1的杀灭效果。这些方法分别或依次应用于三种相关基质：牡蛎、不锈钢（SS；食品接触表面）和低密度聚乙烯（LDPE；包装表面）。通过改良的免疫荧光（IF）检测方法量化了病毒滴度。该方法针对牡蛎基质进行了优化，通过调整病毒吸附时间、抗体条件和缓冲液组成来提高重复性和信号清晰度。使用200 ppm的ClO₂处理5分钟或200 ppm的PAA处理1分钟后，牡蛎组织中的病毒滴度降低幅度大于UV-C辐照（1,800 mJ/cm²处理后的1.8 log₁₀ FFU/mL）。当使用≥700 ppm的ClO₂处理不锈钢或≥1,500 ppm的PAA处理不锈钢，以及使用≥300 ppm的ClO₂处理或≥900 ppm的PAA处理低密度聚乙烯时，HAstV-1的浓度降至检测限以下。UV-C辐照在3,600 mJ/cm²处理下，不锈钢和低密度聚乙烯上的病毒滴度分别降低了1.37和1.63 log₁₀ FFU/mL。将ClO₂（50 ppm）或PAA（150 ppm）与后续的UV-C辐照（600 mJ/cm^{2₁₀ FFU/mL。质地和颜色分析显示硬度及咀嚼性略有下降（p < 0.05）；然而，弹性或颜色参数没有显著差异（p > 0.05）。改良的IF检测方法具有更好的重复性和信号清晰度，成功用于检测牡蛎基质中的传染性HAstV-1。}

引言

1975年，这种名为AstV的病毒首次在英格兰的一所幼儿园中被发现（Jeong等人，2012年）。AstV是一种小型（直径28–30纳米）、无包膜的单链正RNA病毒，属于Astroviridae家族（De Benedictis等人，2011年）。自2000年代末以来，不断有新的AstV基因型被报道，表明该病毒的多样性及其引起的感染范围非常广泛（Cortez等人，2017年）。血清型1至8的流行率和致病性各不相同，其中血清型1的流行率最高（Bosch等人，2014年；Meyer等人，2021年）。根据韩国疾病控制与预防中心（KCDC）2002年至2007年的研究，人类AstV（HAstV）血清型1（HAstV-1）是主要基因型，占HAstV阳性病例的72.19%（Jeong等人，2011年）。AstV是目前了解最少的肠道RNA病毒之一，目前尚无可用疫苗（Cortez等人，2017年；Ushijima等人，2023年）。由于其能够感染多种宿主且缺乏交叉基因型免疫，AstV对公共卫生构成重大风险，尤其是在食品安全方面（Cable等人，2023年）。

AstV主要感染5岁以下的儿童，因为他们的免疫系统较弱，更容易感染该病毒（Cortez等人，2017年）。全球范围内，AstV导致0.5%至15%的腹泻病例，在发展中国家感染率更高，可达30%（De Benedictis等人，2011年；Medina等人，2000年）。在韩国，2019年至2023年间，AstV占病毒性感染的9.5%（Lee等人，2024年）。这一高检出率可能与2019冠状病毒病（COVID-19）大流行后社交距离措施的解除以及病毒诊断技术的进步有关。此外，病毒诊断技术的改进使得更多轻症和无症状感染病例被检测出来（Lee等人，2024年；Lephart等人，2021年）。AstV感染的主要症状包括腹泻，可能伴有呕吐、腹部不适和低烧。这些症状通常较轻，可自行缓解，但在免疫功能低下的人群中可能会出现严重和持续的感染（Cortez等人，2017年；Manglic等人，2024年）。

AstV主要通过人与人之间的接触传播，但饮用受污染的水和食用受污染的海鲜也被认为是重要的感染途径（Mattison等人，2021年）。2014年韩国光州发生的HAstV疫情（Hwang等人，2015年）显示，受污染的水净化器导致了超过30例感染，突显了水传播的潜在风险，因此需要安全的管理饮用水来控制AstV。此外，包括牡蛎、贻贝和蛤蜊在内的贝类是AstV的重要传播媒介（Beikpour等人，2023年；Elamri等人，2006年；Gabrieli等人，2007年；Le Guyader等人，2000年，2008年）。值得注意的是，牡蛎会主动从受污染的水中吸收病毒，并且经常生食，这增加了感染的风险（Appleton，2000年；Beikpour等人，2023年）。AstV在海水中可存活长达90天，并且可以通过食物接触和环境表面保持传染性（D'Souza等人，2006年；Gagné等人，2022年；Sabbah等人，2010年；Schultz-Cherry，2014年）。已知肠道病毒主要在牡蛎的消化组织中积累，特别是在中肠腺体中，这些部位不受表面消毒方法的影响（Matsuyama等人，2024年；Richards，2016年）。尽管贝类的主要污染发生在水环境中，但采后处理步骤（如去壳或包装）也可能导致二次病毒污染（Richards，2016年）。由于净化效果有限，且热处理对于生食来说不切实际，因此需要针对表面污染的消毒策略来降低海鲜加工过程中的病毒传播风险。

有多种消毒技术用于减少或灭活海鲜中的病原微生物（Narita等人，2020年）。二氧化氯（ClO₂）和过氧乙酸（PAA）可以氧化肠道病毒的蛋白质，破坏其结构，使其无法结合或穿透宿主细胞（Wigginton等人，2012年）。与PAA相比，ClO₂在鲜切食品行业中具有显著优势，例如比氯具有更低的腐蚀性，对氮或氨不敏感，从而避免产生有害副产物，且不会形成三卤甲烷（Meireles等人，2016年）。其氧化能力高于次氯酸，因此在食品工业中广泛用作消毒剂。即使在低浓度下，ClO₂也非常有效（Tomás-Callejas等人，2012年）。2007年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准在海鲜中残留3 ppm的ClO₂（FDA，2017年）。同样，PAA也是一种抗菌剂，广泛用于饮用水和食品的消毒（Du等人，2018年）。自2018年起，韩国食品药品安全部（MFDS）批准将其作为食品添加剂使用（MFDS，2018年）。PAA对环境友好，因为它会迅速分解为醋酸、水和氧气，不会留下有害残留物（Choi等人，2022年；Gawande等人，2013年）。即使与有机物接触，它仍保持杀菌性能（MFDS，2022年）。在低温环境中，PAA也非常有效，适用于需要保持低温的海鲜加工（Liu等人，2024年）。这些特性使得PAA成为一种有前景的海鲜加工消毒剂，既考虑了微生物安全，也考虑了环境可持续性。

紫外线-C（UV-C）利用短波长破坏DNA或RNA，提供了一种无需化学处理即可有效灭活或减少食品中病原微生物的方法（Singh等人，2021年）。由于其成本效益和环境友好性，UV-C被广泛用于多种食品的消毒和延长保质期，包括肉类、家禽、海鲜和蔬菜（Butot等人，2018年；Sharma等人，2023年；Vassal等人，2023年）。

AstV不会引起细胞病变效应（CPE），因此传统的感染性检测方法（如斑块检测和50%组织培养感染剂量（TCID₅₀）不适合检测它（Méndez等人，2014年）。最近，定量PCR（qPCR）被广泛用于检测病毒遗传物质（DNA或RNA）。然而，免疫荧光（IF）检测方法可能适用于AstV的检测。IF检测方法灵敏且成本低廉，可以直接观察受感染的细胞（Madeley & Peiris，2002年）。然而，qPCR无法区分样本中的传染性和非传染性病毒颗粒，可能导致对病毒滴度的过高估计（Calgua等人，2011年）。因此，IF检测方法在消毒研究中能更准确地评估病毒传染性。不过，商业推荐的IF协议主要是为标准细胞培养系统设计的（Novus Biologicals，2020年），尚未针对牡蛎等食品基质进行优化。因此，需要开发一种新的、优化的IF协议，以更有效地增强荧光信号，减少背景染色，并在清洗过程中防止宿主细胞脱落，特别是在贝类行业中检测AstV时。

本研究的目的是开发一种优化的IF方法，以提高牡蛎加工环境中传染性HAstV-1检测的可靠性和重复性。此外，还分别和依次评估了化学处理（ClO₂和PAA）和物理处理（UV-C）作为病毒控制策略在各种基质上的效果，包括牡蛎组织、食品接触不锈钢（SS）表面和低密度聚乙烯（LDPE）包装材料。最后，通过质地和颜色分析评估了这些处理对牡蛎质量的影响，以确保其在海鲜加工环境中的实际应用性。

部分内容摘录

细胞培养

细胞由忠?大学的Chang-sun Choi教授提供。细胞接种在T-75 cm²培养瓶中，当形成90–100%的致密单层且肉眼可见细胞边界时进行传代，传代时间为3–5天。吸出细胞培养基，然后用Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS；Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）冲洗两次。培养瓶在含有1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA的条件下孵育

优化IF检测方法以检测牡蛎中的传染性HAstV-1

为了能够在不同基质（包括悬浮液、牡蛎组织和LDPE）中敏感地检测传染性HAstV-1，新开发了一种ICC/IF方法。初始方案产生的荧光较弱且分散，背景噪声较强，尤其是在牡蛎和LDPE表面上，这阻碍了病毒传染性的准确量化。为了解决这些问题，建立了一个12步优化的IF程序以改善信号均匀性

讨论

AstV是一种高度流行的食源性病毒，是急性胃肠炎的主要原因，尤其是在免疫功能低下的人群中。值得注意的是，高达90%的儿童至少接触过一种AstV株，反映了其广泛的传播（Schultz-Cherry，2013年；Vu等人，2017年）。该病毒具有很高的环境稳定性，对常规消毒方法具有抗性，且感染剂量较低（Kramer等人，2006年）。尽管最近有大型食源性疫情的报道（Fu等人，

结论

使用新改良的IF检测方法，分别和依次评估了ClO₂、PAA和UV-C辐照对牡蛎组织、SS和LDPE表面上HAstV-1的抗病毒效果。本研究开发的IF方案改进了细胞脱落情况，优化了抗体浓度和孵育时间，以提高荧光信号强度，从而实现均匀染色且无抗体聚集。这些改进提高了检测的可靠性和

CRediT作者贡献声明

哈尚铎：撰写 – 审稿与编辑，监督，项目管理，概念构思。朴诗宏：研究。宋惠元：撰写 – 初稿，方法学，研究，数据分析，概念构思。韩尚哈：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 初稿，研究，数据分析，概念构思。李孝彬：可视化，软件操作。文妍仁：软件支持

未引用的参考文献

Chemicals, 2025; Chlorine dioxide, 2025; Monroe et al., 1991; Ortiz-Solà et al., 2022.

利益冲突声明

作者未报告任何潜在的利益冲突

致谢

本研究得到了忠?大学在2023年的研究资助，以及韩国食品药品安全部在2025年的资助[资助编号21153MFDS605]。