超越禁令：在欧盟法规框架下，以肉类为食的Hermetia illucens幼虫的细菌微生物群分析

《Food Research International》：Beyond the ban: Bacterial microbiota analysis of Hermetia illucens larvae meat-fed in the context of EU regulation.

本研究首次分析黑军蚕幼虫（BSFL）在含生肉和加工肉前食品的养殖基质上的细菌微生物群，并评估禁食、冲洗和乙醇清洗的影响。结果表明，基质类型显著改变幼虫微生物群，处理后变化有限，未检出主要食源性病原体，但发现Sphingobacteriaceae家族细菌。该发现支持BSFL在循环经济中的应用，但需进一步微生物评估。

　　

Gabriele Spatola|Emma Copelotti|Simone Mancini|Asia Zanzot|Roberta Nuvoloni|Angela Trocino|Alice Giusti|Andrea Armani

比萨大学兽医科学系，Viale delle Piagge 2号，56124，比萨，（PI），意大利。

摘要

食用昆虫作为一种可持续的动物蛋白来源，正在受到越来越多的关注，用于食品和饲料生产。在欧盟，已经批准了几种昆虫物种用于此类用途。昆虫养殖必须遵守欧洲的食品和饲料法规，这些法规禁止在养殖基质中使用肉类和鱼类作为成分。黑水虻（Hermetia illucens）幼虫（BSFL）是一种可持续的食品和饲料选择，能够将前食品产品（FFPs）转化为富含蛋白质的生物质。然而，关于安全性的担忧仍然存在，需要进一步的数据来评估使用基于肉类和鱼类的FFPs作为BSFL基质所带来的风险。本研究旨在表征在含有原始和加工肉类FFPs的基质上饲养的BSFL的细菌微生物群，并评估饲养后处理（禁食、冲洗和乙醇（EtOH）清洗）的效果。测试了三种基质：一种是100%植物基的对照组（C），另外两种分别含有25%的原始肉类（R）和25%的加工肉类（P）。在饲养结束时、禁食24小时后、冲洗后以及70%乙醇清洗后，对BSFL进行了采样。通过测序16S rRNA V3–V4区域，分析了饲养基质和BSFL的细菌微生物群。主要菌属包括Pseudomonas spp.、Providencia spp.、Myroides以及Sphingobacteriaceae家族。基质类型显著影响了BSFL的细菌微生物群，而禁食、冲洗和乙醇清洗的影响有限。值得注意的是，没有检测到任何主要食源性病原体的序列；而Staphylococcus spp.的序列仅在饲养基质中被检测到，而在BSFL中未检测到。这些发现支持了BSFL在循环经济策略中的潜力，尽管在使用基于肉类的FFPs作为昆虫饲养基质之前，仍需进行进一步的微生物学评估。

引言

由于人口增长和饮食习惯的变化，全球对动物蛋白的需求不断增长，这对土地、水资源和饲料资源造成了压力。因此，许多研究正在探索新的可持续动物蛋白来源，食用昆虫被认为是一个有前景的替代方案（Henchion等人，2017年）。2013年，联合国粮农组织（FAO）提出将食用昆虫作为食品和饲料安全的候选选项（Van Huis等人，2013年）。在欧盟层面，“陆生无脊椎动物”被纳入欧盟饲料目录（法规EU No 68/2013），正式承认昆虫为合法的饲料成分。随后，在2015年，欧洲食品安全局（EFSA）发布了关于昆虫作为食品和饲料生产和消费的风险评估的初步科学意见（EFSA，2015年）。

十年后，共有19项关于将各种昆虫物种作为新型食品授权的申请提交给了欧盟委员会（EC）。其中7项获得了EFSA的积极评估，现已获得授权（表1）。

昆虫被用于喂养养殖动物和宠物。预计饲料领域将成为欧盟昆虫产业中增长最快的部分，尽管仍存在法律限制（Gambelli等人，2024年；Sogari等人，2023年）。事实上，根据动物副产品（ABP）法规（法规（EC）No. 1069/2009和法规（EU）No. 142/2011）以及传染性海绵状脑病（TSE）法规（法规（EC）No. 999/2001），只有来自8种昆虫（包括黑水虻H. illucens）的加工动物蛋白（PAPs）被允许用于水产养殖动物、家禽和猪的饲料。相反，欧盟立法禁止使用未经处理的或经过“处理”（即干燥冷冻但未改变产品物理特性的）整只昆虫作为饲料；而活昆虫则可能被欧盟成员国的国家当局批准用于非反刍动物的饲料。在这方面，意大利卫生部已批准将上述物种的活昆虫作为家禽、猪和鱼的饲料（卫生部通告，2023年9月18日）。

生产符合消费者期望的营养食品，同时保持质量、确保安全并支持循环经济体系已成为一个关键挑战（Henchion等人，2017年；Ojha等人，2020年）。然而，在食品供应链中，大约三分之一的食品在生产和消费过程中被损失或浪费。由于这些食品的创造、加工、运输和储存需要能源，这些损失和废弃物对环境产生了显著的负面影响。其中，前食品产品（FFPs）是一个主要的未被利用的资源（Featherstone，2014年；Giromini等人，2017年；Pinotti等人，2019年）。FFPs原本是用于人类消费的食品，因此是按照食品安全法规生产的。但由于实际或物流问题、生产缺陷或包装故障，它们不再用于此目的。如果FFPs不构成任何健康风险，就可以将其用作饲料（欧盟法规No. 68/2013）。然而，ABP法规也禁止将含有肉类或鱼类的FFPs用作食品生产动物的饲料（委员会通知，2018/C133/02，法规（EU）No 142/2011）。因此，FFPs在食品生产动物中的使用仍然有限，仅占饲料行业的3.3%，每年欧盟产生的8900万吨食品废弃物中只有500万吨FFPs被重新利用（Pinotti等人，2019年）。

许多昆虫物种能够以高效和可持续的方式从这些产品中提取高质量的蛋白质和脂肪。在这方面，昆虫普遍表现出显著的生物转化能力，当前的研究工作集中在探索不同物种如何将有机废物和食品副产品（例如FFPs）转化为有价值的二次产品（Fowles & Nansen，2019年）。H. illucens幼虫（BSFL）是一种可行的食品和饲料来源，为食品废物和FFPs的可持续生物转化提供了有希望的解决方案（Hopkins等人，2021年）。然而，在BSFL被完全视为安全用于食品应用之前，仍存在一些挑战。尽管一些研究表明，在不同基质上饲养的BSFL中可以抑制食源性病原体（Gorrens等人，2021年；Huang等人，2020年；Lin & Shelomi，2024年），但病原菌的潜在积累仍然是一个问题（Bessa等人，2021年；Brulè等人，2024年）。

迄今为止，只有一项研究通过培养依赖的方法分析了在含肉基质上饲养的BSFL的微生物组成（Brulè等人，2024年）。然而，鉴于分析样本数量有限，还需要利用“组学”方法来更好地理解微生物组成、功能潜力以及幼虫生态系统内的相互作用（Brulè等人，2024年）。下一代测序（NGS）技术及其“组学”方法为食品链中的微生物风险评估提供了宝贵的见解（Cocolin等人，2018年）。特别是宏基因组分析，也称为扩增子测序，可以提供全面的定性数据，有助于未来的微生物风险评估。此外，多项研究评估了使用不同饲养基质（包括含肉基质）饲养的BSFL的细菌微生物群变化，其中一些研究考虑了含肉的饲养基质（Lin & Shelomi，2024年；Silvaraju等人，2024年）。然而，尽管基于NGS的方法使用日益增多，但关于在含肉FFPs基质上饲养的BSFL的细菌微生物群的研究仍然非常有限，特别是在欧盟法规限制的情况下。

本研究首次旨在表征在含有肉基FFPs（原始和加工）的基质上饲养的BSFL的细菌微生物群，并评估饮食组成和饲养后处理（禁食和清洗）对幼虫微生物群结构的影响。尽管扩增子测序存在局限性，但这些发现为了解饲养基质如何影响BSFL的细菌微生物群提供了新的见解，有助于未来的微生物风险评估和关于使用肉基FFPs作为饲料的潜在法规发展。

饲养基质和组成

准备了三种饲养基质：i) 作为对照组的Gainesville饲料（30%苜蓿、50%小麦麸皮和20%玉米粉）（C）；ii) 混合25%原始肉类和75% Gainesville饲料制成的（R）；iii) 混合25%加工肉类和75% Gainesville饲料制成的（P）。用于R基质的原始肉类按1:1:1的比例混合了猪里脊肉、鸡肉和火鸡胸肉。对于P基质，加工肉类也按1:1:1的比例混合（猪火腿）。

细菌微生物群分析的宏基因组学方案

从饲养基质中提取的总DNA平均浓度为723.67 ng/μl，范围从415.55到1060.75 ng/μl；而从幼虫中提取的平均浓度为744.63 ng/μl（范围从109.05到1962.7 ng/μl）。所有样本的A260/A280和A260/A230比值分别在1.76–2.15和1.03–2.11之间。由于LPG协议要求最低浓度为5 ng/μl，所有样本都适合进一步分析。从所有样本中扩增了V3-V4目标16S rRNA。

结论

这是首次评估在含有肉基FFPs的基质上饲养的BSFL的细菌微生物群的研究。总体而言，我们的结果表明，基质组成比饲养后处理对BSFL的细菌群落影响更大。此外，当饲养基质中含有加工肉基FFPs时，微生物丰富度和均匀性有所降低。然而，一些共有菌属仍然存在。

资金和支持

本工作得到了比萨大学“PRA – Progetti di Ricerca di Ateneo”（机构研究资助）项目的支持——项目编号13 PRA_2022–2023_“基于昆虫的食品和饲料风险评估的下一代测序（NGS-Ins）”。此外，还得到了“Open Science in Co-Creative Animal Research” OSCAR项目的支持。

手稿准备过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备本作品时，作者使用了[Chatgpt(GPT5)]来根据作者提供的信息生成图形摘要。

CRediT作者贡献声明

Gabriele Spatola：撰写——初稿，研究，数据分析。Emma Copelotti：撰写——初稿，研究，数据分析，概念化。Simone Mancini：撰写——审稿与编辑，撰写——初稿，监督，数据分析，概念化。Asia Zanzot：研究，数据分析。Roberta Nuvoloni：撰写——审稿与编辑，研究。Angela Trocino：研究，数据分析。Alice Giusti：撰写——审稿与编辑，

未引用参考文献

欧盟委员会法规，2001年

欧盟委员会法规，2009年

欧盟委员会法规，2011年

欧盟委员会法规（EU），2025年

欧洲食品安全局科学委员会，2015年

Garofalo等人，2017年

卫生部，2023年

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。