《Genes & Diseases》：A Multi-omic atlas identifies osteopontin-expressing macrophages as drivers of intervertebral disc degeneration
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椎间盘退行性变（IVDD）缺乏有效干预手段，其基质降解的免疫驱动机制尚不明确。本研究中，研究者整合单细胞测序、细胞通讯、外泌体生物学与孟德尔随机化等多种技术，聚焦SPP1+巨噬细胞在IVDD中的作用。研究发现该类巨噬细胞通过外泌体传递SPP1，诱导髓核细胞（NP）发生分解代谢表型，而沉默SPP1后其外泌体可逆转此过程。研究在动物模型中证实了靶向SPP1的治疗潜力，并通过遗传学证据揭示了循环SPP1与IVDD风险的因果关系。这项研究为开发靶向外泌体SPP1的疾病修饰疗法提供了新方向。
腰痛是困扰全球数百万人的常见顽疾，而其最主要的根源之一便是椎间盘退行性变。想象一下，我们的椎间盘就像一个个充满弹性的“水垫”，位于每节脊椎骨之间，负责缓冲冲击、维持脊柱的灵活与稳定。然而，随着年龄增长、不良姿势或长期劳损，这些“水垫”会逐渐失去水分和弹性，其内部的细胞（主要是髓核细胞）功能失常，支撑结构的细胞外基质（如蛋白聚糖Aggrecan和II型胶原COL2A1）被过度降解，最终导致椎间盘高度降低、突出，引发疼痛和神经压迫。尽管疼痛管理和手术能缓解症状，但医学界至今缺乏能够从根本上延缓或逆转这一退化过程的“疾病修饰疗法”。一个关键的科学谜题是：究竟是什么驱动了椎间盘内这种破坏性的基质降解？近年来，越来越多的证据指向了免疫系统，特别是浸润到退变椎间盘中的巨噬细胞，但它们具体如何“作恶”，其核心“武器”又是什么，仍然模糊不清。
为了破解这个谜题，由Qiuwei Li、Liang Kang、Kaida Bo、Peilin Jin、Chenhao Zhao、Renjie Zhang和Cailiang Shen组成的研究团队开展了一项雄心勃勃的多组学研究。他们不再满足于传统的单一技术观察，而是构建了一个整合了单细胞转录组学、细胞间通讯分析、外泌体功能研究、机器学习以及遗传学因果推断的强大分析框架，旨在全景式地揭示椎间盘退变的细胞与分子机制，并寻找可干预的关键靶点。他们的研究成果最终发表在国际期刊《Genes》上，为我们理解并潜在治疗椎间盘退变带来了新的希望。
为了系统性地回答上述问题，研究人员综合运用了多项关键技术。首先，他们建立了可重复的大鼠压力诱导椎间盘退变模型，以模拟人类疾病的机械应力致病过程。研究的核心是单细胞RNA测序技术，他们对模型动物的椎间盘组织进行测序，以在单细胞分辨率下解析退变过程中的细胞异质性和转录组变化。在此基础上，他们利用生物信息学工具（如CellChat）推断了不同细胞类型（特别是巨噬细胞与髓核细胞）之间的通讯网络。为了验证SPP1的功能，他们从巨噬细胞中分离了外泌体，并在体外和体内实验中，通过椎间盘内注射的方式，评估了来自SPP1基因敲低巨噬细胞的外泌体的治疗效果。为确立因果关联，研究采用了孟德尔随机化分析，利用蛋白质数量性状位点作为工具变量，评估了循环SPP1水平与椎间盘退变风险的遗传学因果关系，并辅以共定位分析以确认共享的遗传信号。此外，机器学习方法被用于从复杂数据中识别预测退变状态的关键生物标志物模块。最后，人类椎间盘组织样本（根据术前MRI Pfirrmann分级分为轻度和重度退变组）的免疫组化分析，验证了SPP1表达与人类疾病临床严重程度的相关性。
研究结果
1. 建立和验证压力诱导的大鼠IVDD模型
研究人员成功构建了一个可控的压力诱导大鼠椎间盘退变模型。经过4周的压力加载，模型动物的椎间盘在分子（如ADAMTS5、MMP3表达升高，Aggrecan、COL2A表达降低）、影像学（X光、MRI显示椎间隙变窄、信号减弱）和组织学（HE、Safranin O染色显示结构破坏、蛋白聚糖丢失）层面均表现出典型的退行性改变，证实了模型的有效性。
2. 单细胞转录组图谱鉴定出退变椎间盘中SPP1+巨噬细胞的扩增
通过对模型椎间盘进行单细胞RNA测序，研究人员在16,433个高质量细胞中鉴定出19个不同的细胞群。他们发现，在退变椎间盘中，表达骨桥蛋白的巨噬细胞（SPP1+Mac）群体显著扩增。这些细胞展现出独特的促炎症转录特征。细胞通讯分析显示，SPP1+巨噬细胞与髓核细胞之间的相互作用在退变组中最强，提示SPP1信号通路是连接免疫细胞与椎间盘基质细胞的关键桥梁。
3. 机械压力诱导髓核细胞产生分解代谢表型
体外实验表明，机械压力（500 Pa）可以直接诱导原代大鼠髓核细胞发生分解代谢改变，表现为Aggrecan和COL2A1表达下降，促凋亡蛋白Bax上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调，细胞凋亡率增加，证实了机械应力对髓核细胞的直接损害。
4. SPP1基因敲低巨噬细胞来源的外泌体的表征和功能评估
研究人员从脂多糖刺激的巨噬细胞和SPP1基因敲低的巨噬细胞中分离出外泌体。这些外泌体具有典型的形态和标志物。功能实验发现，来自SPP1基因敲低巨噬细胞的外泌体，能够被髓核细胞有效摄取，并部分逆转由压力诱导的MMP3表达上调和SOX9/COL2A1表达下调，显示出保护作用。
5. SPP1基因敲低外泌体通过直接的蛋白质-蛋白质相互作用保护髓核细胞
进一步的机制探索发现，SPP1基因敲低外泌体的保护作用与其调节细胞凋亡（恢复Bcl-2/Bax平衡）和基质合成（部分恢复Aggrecan、COL2A1）有关。更重要的是，免疫共沉淀实验直接证实了SPP1蛋白与椎间盘基质关键成分Aggrecan和COL2A1存在物理相互作用，这为SPP1直接参与基质降解提供了分子证据。
6. 体内验证和人类组织分析确认临床相关性
在大鼠模型中，椎间盘内注射SPP1基因敲低巨噬细胞的外泌体，能够显著减轻模型的组织学退变程度，改善MRI和微CT影像学评分，保护椎间盘高度和结构。对人类患者椎间盘标本的分析显示，在严重退变（Pfirrmann III-IV级）的椎间盘中，SPP1的表达水平显著高于轻度退变（I-II级）组，且两者呈强正相关，证明了研究发现在人类疾病中的临床意义。
7. 孟德尔随机化和共定位分析确立遗传因果关系
为了超越相关性，确立SPP1与椎间盘退变之间的因果联系，研究者进行了两样本孟德尔随机化分析。结果发现，遗传学上代理的较高循环SPP1水平，会显著增加罹患椎间盘退变的风险。共定位分析进一步提供了强有力的证据，表明SPP1的遗传信号与椎间盘退变的遗传风险共享同一个因果变异，大大降低了混杂因素干扰的可能性，从遗传学角度支持了SPP1是椎间盘退变的驱动因素。
8. 机器学习分析识别SPP1/CD86模块作为预测性生物标志物
利用机器学习方法对单细胞数据进行分析，发现以SPP1和CD86等基因为核心的基因模块，是区分退变与正常椎间盘状态的最具预测性的特征，其构建的分类模型具有极高的准确性，这为未来开发基于生物标志物的诊断或预后工具提供了线索。
9. 独立数据集验证确认SPP1+巨噬细胞程序的普适性
在另一个独立的针穿刺法椎间盘退变大鼠模型单细胞数据集（GSE211407）中，研究人员再次观察到了SPP1+巨噬细胞的扩增以及类似的细胞通讯模式，证明了该发现在不同退变模型中的可重复性和普适性。
10. SPP1基因敲低外泌体通过恢复自噬-溶酶体通路稳态发挥作用
深入的机制研究发现，机械压力会破坏髓核细胞的自噬-溶酶体通路稳态，表现为溶酶体标志物LAMP1减少和自噬标志物LC3-II积累。而SPP1基因敲低外泌体的治疗可以恢复LAMP1水平并正常化LC3A/B表达。当使用氯喹阻断自噬流时，外泌体的保护作用被取消。透射电镜也观察到了相应的超微结构变化。这表明，调节自噬-溶酶体通路是SPP1基因敲低外泌体发挥保护作用的重要机制之一。
研究结论与意义
这项多组学研究汇聚了来自转录组学、细胞生物学、外泌体干预、遗传学和计算生物学等多个维度的证据，强有力地将SPP1+巨噬细胞确立为椎间盘退变的关键驱动者。研究揭示，在退变环境中，这类巨噬细胞通过分泌富含SPP1的外泌体，与髓核细胞进行活跃的通讯。SPP1不仅可能通过直接结合并影响基质蛋白（如Aggrecan、COL2A1）来促进降解，还能通过破坏细胞的自噬-溶酶体稳态加剧损伤。而靶向沉默巨噬细胞的SPP1后，其产生的外泌体则能发挥保护作用，在动物模型中有效延缓椎间盘退变。
这项研究的突破性意义在于：首先，它超越了以往多为描述性的关联研究，通过功能获得（野生型外泌体）和功能缺失（SPP1敲低外泌体）实验，并结合遗传学因果推断（孟德尔随机化），在分子、细胞、动物和遗传多个层面建立了SPP1与椎间盘退变之间的因果关系链。其次，它将治疗策略聚焦于“细胞间通讯的信使”——外泌体，提出了“外泌体导向的SPP1阻断”这一极具转化潜力的新型治疗概念。通过改造供体细胞（巨噬细胞）的外泌体货物，来治疗目标组织（椎间盘），为开发精准、微创的疾病修饰疗法提供了全新思路。最后，研究在独立数据集和人类临床样本中均得到验证，显著提升了其科学可靠性和临床相关性。总之，该工作不仅深化了对椎间盘退变免疫病理机制的理解，更重要的是，指明了一个具体且可操作的药物靶点（SPP1）和递送载体（外泌体），为最终攻克这一导致全球性疼痛和残疾的疾病带来了崭新的希望。
