《Horticultural Plant Journal》：PlMYB34-PlABI5 synergistically regulate
Paeonia lactiflora seed dormancy
via ABA metabolism and signaling pathways
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本研究聚焦芍药(Paeonia lactiflora)种子休眠深、育种效率低的关键产业难题，旨在揭示脱落酸(ABA)调控休眠的分子机理。研究人员鉴定到ABA信号通路核心转录因子PlABI5及其互作蛋白PlMYB34，发现二者通过协同上调ABA合成基因PlNCED2和信号负调控基因PlPP2C24的表达，形成ABA积累与信号敏感性的正反馈环路，从而精准调控种子休眠。该研究为克服芍药种子休眠、加速育种进程提供了重要理论依据和关键分子靶点。
芍药(Paeonia lactiflora)是中国传统名花，兼具极高的观赏和药用价值。然而，其种子具有极强的休眠特性，自然条件下解除休眠需要长达6-7个月的时间，这严重制约了芍药的繁殖效率、育种进程和品种改良。种子休眠是植物适应环境、保障繁衍的重要策略，而植物激素脱落酸(Abscisis acid, ABA)在其中扮演着核心调控角色。尽管ABA调控种子休眠的框架在拟南芥等模式植物中已有较多研究，但在芍药这一重要园艺作物中，其具体的分子机制仍知之甚少。破解芍药种子休眠的“黑匣子”，对于实现其高效育种和产业化发展具有迫切的现实意义。为此，沈阳农业大学的一个研究团队展开深入探索，相关成果发表在《Horticultural Plant Journal》上。
为了揭示ABA调控芍药种子休眠的分子机制，研究人员综合运用了多种现代分子生物学技术。研究材料为2022年9月采集的芍药杂交种子（‘粉玉女’ב粉玉楼’），并通过沙藏层积处理获得了处于不同休眠释放阶段（S1：干种子；S2：吸胀种子；S3：胚根突破种皮）的样本。关键实验技术包括：基于转录组数据的基因克隆与生物信息学分析；农杆菌介导的芍药种子胚瞬时过表达与基因沉默技术，用于功能验证；RNA提取与实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，用于基因表达分析；酶联免疫吸附测定(ELISA)，用于内源ABA含量检测；DNA亲和纯化测序(DAP-seq)，用于在全基因组范围鉴定转录因子PlABI5的DNA结合位点；以及一系列蛋白互作与转录调控验证技术，如酵母双杂交(Y2H)、双分子荧光互补(BiFC)、荧光素酶互补成像(LCI)、GST pull-down、酵母单杂交(Y1H)、双荧光素酶报告基因(Dual-LUC)和电泳迁移率变动分析(EMSA)等。
3.1. ABA regulates dormancy in P. lactiflora seeds
研究人员首先确认了ABA在芍药种子休眠中的核心作用。随着层积处理推进，种子从深休眠（S1）到休眠逐步释放（S2、S3），胚轴下胚轴显著伸长，同时内源ABA含量显著下降。外源施加100 μmol·L-1的ABA能强烈抑制胚的萌发和下胚轴伸长。这些结果证实，ABA水平的波动与芍药种子休眠状态的维持与解除密切相关。
3.2. PlABI5 positively regulates seed dormancy in P. lactiflora
通过对芍药种子休眠释放转录组数据的挖掘，研究人员鉴定到一个ABA信号通路的核心转录因子基因PlABI5。表达分析显示，PlABI5的表达量随着休眠释放而下降，并能被外源ABA快速诱导。PlABI5蛋白在烟草叶片中主要定位于细胞核，ABA处理会使其完全核定位；在芍药种子中，休眠期（S1）PlABI5信号集中于细胞核，而在休眠释放期（S2）则核信号减弱并出现于细胞质，提示其亚细胞定位变化可能与功能转换相关。功能实验表明，瞬时过表达PlABI5能显著抑制下胚轴伸长并降低萌发率，而沉默PlABI5则促进萌发，证明PlABI5是芍药种子休眠的正向调控因子。
3.3. PlABI5 positively regulates PlPP2C24 to participate in the control of seed dormancy in P. lactiflora
为阐明PlABI5的调控网络，研究人员利用DAP-seq技术在全基因组范围内鉴定了PlABI5的结合位点，发现其结合峰显著富集于ABA信号通路相关基因。其中，一个2C型蛋白磷酸酶基因PlPP2C24被确定为PlABI5的直接靶标。PlABI5能够通过结合PlPP2C24启动子区的ABA响应元件(ABRE)来激活其表达。功能上，过表达PlPP2C24会轻微提高种子内ABA含量，抑制下胚轴伸长和萌发。
3.4. PlMYB34 interacts with PlABI5
通过酵母双杂交文库筛选，研究人员发现一个MYB家族转录因子PlMYB34能与PlABI5发生互作。一系列体内（BiFC、LCI）和体外（Pull-down）实验证实了二者相互作用的真实性。PlABI5的bZIP结构域和PlMYB34的C端区域是互作所必需的。此外，PlABI5和PlMYB34的启动子均含有ABRE元件，且其活性可被ABA诱导，说明它们自身的表达也受ABA信号调控。
3.5. PlMYB34 is involved in and promotes the dormancy of P. lactiflora seeds
对PlMYB34的功能研究表明，其表达模式在休眠释放过程中先升后降，且能被ABA强烈诱导。PlMYB34定位于细胞核，并具有转录激活活性。与PlABI5类似，过表达PlMYB34抑制种子萌发和下胚轴伸长，而沉默其表达则促进萌发，表明PlMYB34同样是芍药种子休眠的正向调控因子。
3.6. PlMYB34 and PlABI5 synergistically regulate PlPP2C24 to participate in ABA signal-mediated seed dormancy
鉴于PlMYB34与PlABI5互作，研究人员推测PlMYB34也可能参与调控PlPP2C24。实验证实，PlMYB34能直接结合到PlPP2C24启动子区的MYB结合位点(MBS)上。更重要的是，双荧光素酶报告基因实验显示，PlMYB34和PlABI5共同存在时，对PlPP2C24转录的激活作用显著强于单独存在，表明二者在调控PlPP2C24表达上具有协同效应。
3.7. PlMYB34 and PlABI5 jointly promote PlNCED2 transcription in the ABA biosynthesis pathway
除了调控信号通路，研究还发现PlMYB34和PlABI5能将调控网络延伸至ABA生物合成途径。二者能直接结合到ABA生物合成关键限速酶基因PlNCED2的启动子上，并协同激活其转录。这为PlABI5/PlMYB34如何影响内源ABA水平提供了直接机制。
3.8. PlMYB34 and PlABI5 regulate seed dormancy by controlling ABA biosynthesis and signaling pathway
最后的协同功能实验整合了以上发现。同时过表达PlMYB34和PlABI5对种子萌发的抑制和下胚轴伸长的阻碍作用最为强烈，同时能最大程度地上调PlNCED2和PlPP2C24的表达，导致种子内ABA含量最高，并且种子对外源ABA的敏感性也最强。反之，同时沉默这两个基因则产生完全相反的表型。这表明，PlMYB34和PlABI5通过协同上调PlNCED2（促进ABA合成）和PlPP2C24（放大ABA信号敏感性），共同构建了一个强化ABA积累和响应的正反馈环路，从而深度维持种子休眠状态。
综上所述，本研究的结论在于揭示了一个由PlMYB34和PlABI5为核心的协同调控模块，该模块通过整合ABA生物合成与信号传导两条通路，精细调控芍药种子休眠。在种子高ABA环境下，PlABI5和PlMYB34被激活并发生互作，一方面协同促进PlNCED2表达，增加ABA的生物合成；另一方面协同激活PlPP2C24等信号通路基因的表达，增强种子对ABA信号的敏感性。这两个层面共同形成了一个自我强化的正反馈调控环路，从而稳固地维持种子的休眠状态。这一机制的阐明，不仅拓宽了我们对植物种子休眠分子机制的理解，特别是对芍药这类具有重要经济价值的园艺作物，而且为通过分子手段（如调控PlABI5或PlMYB34的表达）打破种子休眠、加速育种周期提供了直接的理论基础和潜在的分子靶点，具有重要的科学意义与应用前景。
