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细胞治疗在神经退行性疾病和脊髓损伤修复中的应用面临伦理限制和分化效率低等问题。本研究通过β-PVDF纳米材料与超声波结合，无需植入即可触发骨髓间充质干细胞（BMSCs）产生外泌体，并促进神经干细胞（NSCs）分化。实验表明超声激活的β-PVDF膜可显著增加BMSCs外泌体产量，且外泌体能诱导NSCs向神经元转化。该技术具有成本低、无免疫排斥、无细胞植入等优势，为临床转化提供了新路径。
Xiheng Lu|Xiangchuang Fan|Jiaxing Liu|Xiaodong Wang|Ruizhi Jiang|Ziyang Zhang|Dongjin Wu|Chaoliang Lv|Hong Liu|Hengxing Zhou
山东大学集成电路学院，中国济南250100
摘要
细胞疗法在治愈神经退行性疾病和脊髓损伤方面显示出巨大潜力，使用的方法包括神经干细胞（NSCs）、骨髓间充质干细胞（BMSCs）以及细胞分泌物。然而，与NSCs相关的伦理限制以及诱导BMSCs分化为神经元的难度限制了基于细胞的疗法和组织工程在临床实践中的应用。外泌体——这种源自细胞的囊泡参与细胞间通信等过程——提供了一个潜在的替代方案。本研究报道了一种简便的策略，通过使用压电纳米材料结合超声波来促进分化。β-相聚偏二氟乙烯（β-PVDF）膜在机械变形时释放电子，产生自供电的电信号，从而显著增强了BMSCs的外泌体生成。这些外泌体随后被用来促进NSCs的分化。这种高效且简单的策略不仅促进了NSCs的分化，还克服了传统干细胞疗法所面临的伦理和可持续性挑战，这对于其临床应用至关重要。
引言
在医学不断取得突破的道路上，脊髓损伤（SCI）和神经退行性疾病长期以来一直是全球未解决的医疗难题[1]。仅在美国，就有大约四百万患者患有阿尔茨海默病，每年有25%的患者因此死亡[2]、[3]、[4]。随着社会的发展和交通的普及，由于不可逆的神经损伤，每年脊髓损伤患者的数量也在增加[5]。由于缺乏有效的治疗方法，受这些疾病困扰的人数持续上升[6]。患者必须忍受神经疾病带来的痛苦直至死亡，这使得这些疾病成为亟待解决的医疗问题。尽管在神经损伤治疗方面已经取得了显著进展，但目前仍缺乏适用于临床应用的实用且有效的方法来克服脊髓损伤和神经退行性疾病[7]、[8]、[9]、[10]。
组织工程是一种有前景的治疗策略，可以通过使用神经干细胞（NSCs）来改善神经缺陷并加速神经恢复[11]。人们普遍认为，NSCs可以重建神经回路并恢复神经功能以治疗这些疾病。2018年的临床案例表明，注射NSCs可以治疗脊髓损伤；然而，NSCs的非可再生性和伦理限制是临床应用的主要障碍[12]、[13]、[14]。人类成年后，NSCs仅存在于特定的脑区，无法提取[15]。与NSCs不同，BMSCs终生存在，可以再生，易于提取，且不会引发伦理问题[16]。此外，自体BMSCs及其分泌物在注入患者体内后不会引起排斥反应。然而，即使使用物理信号纳米材料或生物因子，也只能获得少量的神经元[17]。植入材料和接收物理信号也可能对患者造成二次伤害。
外泌体是细胞分泌的纳米囊泡，含有蛋白质、DNA和其他生物活性成分，在体液中普遍存在，并作为重要的细胞间信使参与疾病进展和正常信号传导[18]。随着细胞疗法的发展，对外泌体的研究也日益增多。例如，发现BMSCs衍生的外泌体携带丰富的功能性分子，包括mRNAs、miRNAs、细胞因子、趋化因子以及免疫调节因子和生长因子，这些成分可以有效地调节免疫细胞的表型和功能[19]、[20]、[21]。目前，BMSCs产生的外泌体已经在美容市场中得到应用，并产生了可观的经济效益。这项技术拥有完整的产业链，其安全性已经经过长期测试[22]。尽管BMSCs分泌的外泌体在加速受损组织再生方面显示出潜力，但其在损伤修复中的应用仍需进一步探索。利用BMSCs产生的外泌体可能为神经修复提供一种安全、无细胞的治疗途径。
压电信号刺激可以通过电压敏感受体影响干细胞的命运[23]、[24]、[25]。先前的研究表明，压电材料可以通过产生电信号来调节干细胞的命运，促进NSCs的分化并诱导BMSCs分化为神经细胞[26]、[27]、[28]。将BMSCs接种在压电材料表面，然后将其放入超声匀浆器（Scientz-ⅡD, SCIENTZ）中，在300W的功率下照射10分钟，可以通过无线电信号刺激BMSCs。据报道，β-相聚偏二氟乙烯（β-PVDF）可以促进BMSCs的神经元分化[7]，但压电信号是否能够促使BMSCs产生的外泌体治愈疾病？此外，β-PVDF具有良好的生物相容性，可以大规模生产，使其成为组织工程的理想材料。然而，其临床应用受到需要手术植入的限制。这提出了一个关键问题：如果β-PVDF可以将BMSCs转化为神经元，那么由BMSCs产生的外泌体是否可以在无需植入的情况下促进NSCs的分化？
在这项研究中，我们提出了一种创新的方法来治疗脊髓损伤和神经退行性疾病。通过将BMSCs接种在β-PVDF膜上，并对其施加超声触发的压电刺激，我们利用β-PVDF膜的振动促进了NSCs的分化，并显著增加了BMSCs产生的外泌体数量。通过提取患者自身的BMSCs，可以在体外生成足够的外泌体，并直接注射到损伤部位以实现治疗效果。这种方法消除了对外源性NSCs或手术植入材料的需求。我们的结果表明，β-PVDF诱导的压电刺激可以有效地增强BMSCs的外泌体分泌，从而促进NSCs的分化。
材料表征
通过扫描电子显微镜（SEM）观察了β-PVDF和α-PVDF薄膜的表面形态。如图1a和图S1所示，两种薄膜都呈现出平坦光滑的形态。β-PVDF的X射线衍射（XRD）图谱结果与JCPDS卡片#42-1649相符（图1b），而α-PVDF与JCPDS卡片#42-1650相符（图S1b）。在β-PVDF的傅里叶变换红外（FT-IR）光谱（图1c）中，观察到1429 cm?1处的特征β相吸收峰（CH2
结论
在本研究中，我们证明了在β-PVDF上接种BMSCs并进行超声刺激可以促进能够加速NSCs分化的外泌体的产生。在β-PVDF上培养的BMSCs表现出类似神经元的形态。这种基于压电的技术生成治疗性外泌体的方法具有多个优势，包括低成本、高效率、可控性、较低的伦理限制和低免疫原性。我们的结果表明，压电基质与超声的结合可以产生
材料
α-PVDF薄膜（厚度26 μm）和β-PVDF薄膜（厚度28 μm）均涂覆有10纳米厚的银层，购自深圳市志美康实业有限公司。CCK-8、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒和SPARKscript II RT试剂盒（含gDNA Eraser）购自SparkJade生物技术有限公司。Calcein/PI（碘化丙啶）细胞活力和细胞毒性检测试剂盒以及Fluo-4 AM购自北京贝泰生物技术有限公司。神经递质包括L-谷氨酸、乙酰胆碱、多巴胺CRediT作者贡献声明
Hong Liu：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，数据管理，概念构思。Lv C.：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿。Zhang ziyang：正式分析。Ruizhi Jiang：数据管理。Xiaodong Wang：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。Jiaxing Liu：撰写 – 审稿与编辑，正式分析，数据管理。Xiangchuang Fan：软件，方法学，正式分析，数据管理。Xiheng Lu：可视化，监督，方法学，研究
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。X. Lu、X. Fan.、H. Liu. 和 H. Zhou. 提出了这个想法。X. Lu、X. Fan.、H. Liu. 和 H. Zhou. 建立了实验测试平台并完成了材料和设备性能的测试。D. Wu、C. Lv. 和 H. Liu. 修改了手稿。Z. Zhang、R. Jiang 和 J. Liu. 讨论并改进了实验细节。所有作者都对本文做出了贡献。
致谢
本工作得到了山东省重大基础研究项目ZR2024ZD13的财政支持。
Xiheng Lu于2021年在济南大学获得硕士学位。此后，他成为山东大学集成电路学院的博士生。他的当前研究重点是干细胞分化，包括物理信号对干细胞成骨和神经发生的诱导。
