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这篇研究论文介绍了一种革命性的方法，通过低温电子断层扫描（cryo-ET）技术直接测定蛋白质在接近生理溶液状态下的对相互作用势（PIP）。该方法无需预先假设相互作用模型或蛋白形状，克服了传统间接方法（如小角X射线散射SAXS）求解反问题带来的不唯一性局限。研究通过测量牛血清白蛋白（BSA）等多种蛋白的空间三维分布，计算径向分布函数（RDF）和平均力势（PMF），并利用正交技术（SAXS和沉降平衡分析超速离心AUC-SE）验证了结果的可靠性。该工作证明了冷冻玻璃化状态可“冻结”溶液平衡态，为理解盐浓度、pH、温度及小分子添加剂如何调节蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）提供了直接、定量的新工具，有望推动蛋白质工程和药物开发领域的发展。
引言
蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）在决定蛋白质功能与特性（如聚集、粘度、相分离）中至关重要。描述PPIs的一个关键物理量是对相互作用势（PIP, U(r)），即在无限稀释极限下，将两个蛋白质从其质心距离无穷远移至距离r所做的可逆功。在有限浓度下，对应的量是平均力势（PMF, W(r,c)），它包含了周围蛋白质的多体效应贡献。PIP是预测蛋白质热力学性质和相行为的基础，因此其实验测定意义重大。目前，小角散射（如SAXS）是通过求解结构因子的反问题来获取PIP的唯一技术，但这需要预先假设相互作用模型和闭合关系，是一种间接方法，无法得到唯一的PIP。本文报告了一种基于低温电子断层扫描（cryo-ET）的直接、无模型方法，用于测定蛋白质的PIP。
结果
PIP的测量
图1a展示了用于测量蛋白质相互作用势的cryo-ET工作流程。该方法基于先前报道的用于纳米颗粒的方案，并针对蛋白质（弱对比度物体、在气-水界面高活性）进行了多项改进。关键步骤包括：通过快速蛋白液相色谱（FPLC）纯化蛋白质以获得明确的单体群；使用Chameleon仪器进行无吸印、可控厚度的快速玻璃化，以减少蛋白质在气-水界面的非特异性吸附；在液氮温度下使用透射电镜（TEM）采集剂量对称的倾斜序列，采用高负离焦值以增强对比度；随后进行倾斜序列对齐、三维重建、颗粒分割，提取蛋白质质心的三维位置。
从三维位置可以数值计算径向分布函数（RDF, g(r)），进而通过可逆功定理（W(r) = -kBT ln[g(r)]）得到PMF。对牛血清白蛋白（BSA）在4 mg/mL、8 mg/mL和16 mg/mL（对应上样浓度约为5.2、10、20 mg/mL）下的测量显示，其PMF曲线与带电软球的预期一致，且在实验浓度范围内随浓度的变化可忽略不计（图2a,b）。这表明测得的PMF本质上代表了有效的蛋白质对相互作用势（PIP）。
为验证结果的可靠性，研究使用了两种与cryo-ET正交的分析技术——SAXS和沉降平衡分析超速离心（AUC-SE）。从cryo-ET位置计算出的BSA结构因子S(q)与SAXS实验测量结果吻合良好（图2c）。同时，研究应用一种新颖的子盒方法（Schnell’s approach）从蛋白质空间位置计算柯克伍德-巴夫积分（KBI, G22∞），其在稀溶液下等同于第二维里系数B22。从cryo-ET获得的KBI值与通过AUC-SE测得的B22值（以及从S(0)浓度依赖性导出的B22）在误差范围内匹配（图2d，表1）。这些交叉验证证实了PIP测量方法的可靠性，并表明玻璃化状态代表了“冻结的”溶液平衡态。
不同条件下BSA的PIP
为展示方法的通用性，研究测量了BSA在不同实验条件下的PIP。增加离子强度（从10 mM到975 mM NaCl）使相互作用的衰减长度从13 nm减小到10 nm，并通过约0.5 kBT部分屏蔽了排斥作用（图3a），这与盐诱导静电排斥减少的预期一致。然而，即使在高盐浓度下，相互作用仍为排斥性，表明除静电作用外，水合或结构力在蛋白质稳定性中也扮演重要角色。
改变pH对PIP的影响比离子强度更显著。在接近BSA等电点（pI ~4.7-4.9）的pH 4.8下，测得的PIP仅显示出约0.15 kBT的能垒，且在短距离处趋向于靠近蛋白质直径的吸引性主极小（图3b），这与该条件下蛋白质系统的预期一致。
温度对PIP的影响也被系统研究。BSA已知在其相图中具有下临界溶液温度（LCST），并在高温下发生液-液相分离（LLPS），这表明温度升高会增强分子间吸引力。在4°C、20°C和40°C下测量BSA的PIP显示，随着温度升高，BSA分子间的净相互作用变得越来越有吸引力（或排斥性减弱）（图3c），这与BSA的已知相图相符。
此外，研究还探究了氨基酸脯氨酸的添加对PIP的影响。在接近等电点的条件下（此时蛋白质净电荷为零，吸引力占主导），添加脯氨酸不会改变蛋白质表面电荷，但能显著改变BSA的PIP：相互作用变为短程（衰减在10 nm而非18 nm），并完全转变为排斥性（图3d）。在高浓度脯氨酸下，PIP的变化主要发生在8.5 nm以下，这很可能由水化层的改变引起。这些结果支持了先前提出的通过小分子弱结合屏蔽吸引作用的胶体稳定化理论框架。
多种其他小蛋白的PIP
该方法被成功应用于其他多种球状蛋白，包括溶菌酶、卵清蛋白、链霉亲和素、血红蛋白和人血清白蛋白（图4a-e）。在所研究的浓度范围内，测得的PMF曲线重叠，所得PIP证实了对所有蛋白都达到了稀溶液极限条件。这些PIP均呈现软球典型的相互作用形式，即一个排斥性核心，其有限的作用范围大约衰减两个蛋白质直径的长度。其中，血红蛋白表现出相对更陡的排斥，这可能源于其等电点接近溶液pH。溶菌酶接近cryo-ET通常考虑的下限尺寸，而该方法同样适用于更大的蛋白质，如脱铁铁蛋白。研究展示了在接近其等电点的pH下，脱铁铁蛋白表现出净吸引相互作用（图4f）。
讨论
本文建立的工作流程和结果确立了cryo-ET作为一种强大的方法，可直接测量从接近断层扫描分辨率下限的小球状蛋白到大分子组装体的蛋白质热力学。该方法仅需微升级样品，即可获取对相互作用势（PIP）、柯克伍德-巴夫积分（KBI）和结构因子等关键热力学量，从而能系统探索离子强度、pH、温度和小分子添加剂如何调节PPIs。这为积累蛋白质在不同条件下的大量数据集提供了途径，可为发展预测性的蛋白质相互作用理论模型奠定基础。经典的DLVO理论被证明不足以解释包括蛋白质在高盐浓度下的稳定性在内的若干实验观察，本文的PIP数据也进一步证实了这一点。
将cryo-ET方法应用于蛋白质溶液时需考虑一些实际问题，如蛋白质在气-水界面的吸附、冰污染、冰厚度不均以及样品倾斜等，本研究通过分析断层图中心部分和对颗粒坐标数组进行数值倾斜等方法解决了这些问题。当前方法的一个基本限制在于它给出的是角度平均的PIP，因此蛋白质表面的任何各向异性（“斑块”状）相互作用都被折叠成一个有效的各向同性势，无法归属到特定位点。此外，该方法最适合在较高浓度下稳定且不易变性的蛋白质。未来，随着cryo-ET领域的快速发展，更高通量、更高质量的数据集，结合更稳健的制样技术、新一代高灵敏度电子探测器和持续的软件开发，将有望降低该方法的检测下限并提高对更弱相互作用的灵敏度。快速发展的原位cryo-ET技术预示着，未来在细胞或组织内直接测量蛋白质相互作用势将成为可能。同样，将该方法应用于生物分子冷凝物内的相互作用分析，有助于阐明驱动相分离的特异性相互作用机制。
结论
本研究提出了一种利用低温电子断层扫描（cryo-ET）技术直接测量蛋白质相互作用势的方法。研究发现，对所有研究的小蛋白测得的平均力势（PMF）对蛋白质浓度的依赖性很弱，因此可被视为有效的对相互作用势（PIP）。重要的是，该PIP的获得无需预先假设相互作用势的解析形式或蛋白质形状。除PIP外，该方法还能测量其他重要的热力学参数，如KBI和结构因子。研究通过AUC和SAXS等正交方法成功验证了该方法的可靠性。此外，该技术还能系统分析不同实验条件下蛋白质相互作用的变化规律：增加离子强度会部分屏蔽排斥作用；接近等电点会导致弱吸引力；温度升高使相互作用排斥性减弱，这与BSA的LCST型相图一致；小分子添加剂（如脯氨酸）可将净吸引相互作用转变为排斥性。该方法有潜力成为直接测量蛋白质PIP的新标准。
