《Biomaterials Science》：Image-based single-cell isolation in high-density seeded cells using photoactivatable surfaces
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本文报道了一种新型的单细胞分离方法。它利用涂覆了可光活化PEG-脂质材料（PEG-lipid 1）的表面，在显微成像后，通过局域光辐照选择性、快速地将目标细胞锚定在基底上。该方法克服了传统技术（如FACS、MACS、毛细管微操作、介电泳等）在细胞密度和复杂表型筛选上的局限，实现了从高密度细胞群中高效、高精度地分离稀有细胞。研究以荷瘤小鼠血液中分离循环肿瘤细胞（CTCs）为概念验证，为细胞分析、诊断和个性化医疗（如液体活检）提供了强大且实用的平台。
文章内容归纳总结
引言
在生物医学领域，实现对单个细胞的精确操控日益重要，尤其是在基础细胞生物学、诊断学及个性化医疗中。以循环肿瘤细胞（CTCs）为代表的稀有细胞类型的单细胞分析，对癌症的早期检测和治疗反应评估至关重要。这催生了对能够从大量异质细胞群体中精确分离和获取特定目标细胞的技术需求。目前，以分子标记为基础的荧光激活细胞分选（FACS）和磁性激活细胞分选（MACS）技术，尽管通量高，但难以基于复杂表型（如详细形态、亚细胞蛋白定位）进行区分，且常导致假阳性或假阴性结果。而结合了显微成像技术与快速细胞获取能力的方法，显示出巨大的应用潜力。然而，现有的毛细管微操纵和介电泳等细胞挑选技术，受限于空间精度，通常需要在低细胞密度下操作，这极大地限制了筛选通量和可扩展性。
本研究提出了一种新方法，旨在克服这些限制。该方法利用涂覆了可光活化聚乙二醇-脂质PEG-lipid 1（图1a）的表面，在细胞接种后，通过光照诱导脂质活化，选择性将目标细胞锚定在基底上（图1b）。基本步骤包括：首先，通过显微成像识别目标细胞；接着，利用光辐照的高速度和高空间分辨率，用光斑选择性照射单个目标细胞，使其锚定在基底上；最后，通过清洗移除未锚定的细胞，实现目标细胞的精确分离（图1c）。本研究验证了该方法在单细胞水平分离模型血细胞的有效性，并成功从荷瘤小鼠血液样本中分离出稀有CTCs，展示了其潜在的临床相关性（图1d）。
材料与方法
实验使用了商品化微通道（μ-Slide VI 0.4）作为基底。首先，在基底上涂覆可光活化PEG-脂质1，制备出可光活化的细胞锚定表面。实验中使用了BaF3小鼠原B细胞、表达增强绿色荧光蛋白的BaF3-EGFP细胞，以及DLD-1人结肠腺癌细胞系作为模型细胞。利用含有CTCs的荷瘤小鼠外周血样本进行了概念验证实验。对于光诱导的细胞锚定，将细胞悬浮液引入微通道，覆盖在修饰过的基底上，然后使用405nm波长、剂量为5 J cm-2的光辐照目标区域。在辐照和孵育后，用PBS冲洗以去除未锚定的细胞。细胞密度和活性通过荧光显微镜成像和图像分析软件（Fiji/ImageJ）进行量化。细胞活性通过钙黄绿素-AM（Calcein-AM）和碘化丙啶（PI）的活/死染色进行评估。
结果与讨论
1. 光诱导的已接种非粘附细胞锚定
实验以非粘附型的BaF3细胞为模型，探究了细胞在接种和成像后，在PEG-脂质修饰表面的光诱导锚定效果。细胞接种后，可观察到基底表面充满细胞（图2a）。对指定区域进行光照后清洗，结果显示，仅在光照区域保留有高密度的细胞，而非光照区域无细胞残留（图2b），证明了即使在细胞接种后，其锚定也具有光依赖性。进一步研究光照剂量对细胞锚定和活力的影响发现，当光照剂量高于5 J cm-2时，可获得高细胞锚定密度，且剂量在5至20 J cm-2之间时，细胞密度基本保持稳定（图2c）。在此剂量范围内，细胞活性未受影响。这表明，使用生物兼容水平的光照剂量，即可将活细胞锚定在可光活化表面上。然而，在分子水平上，光照可能诱导的潜在转录效应，是本研究的一个局限性，也是未来研究的重要方向。此外，对固定细胞的实验表明，与活细胞相比，固定细胞的捕获效率显著降低，提示高效的锚定依赖于活细胞膜的特性。
2. 光诱导细胞锚定的时间进程分析
为了分析细胞锚定所需时间，实验采用激光垂直线扫描细胞接种表面，并立即用PBS冲洗，从而在表面形成14至361秒不等的孵育时间梯度（图3a, b）。结果显示，锚定的BaF3-EGFP细胞密度随着孵育时间的延长而增加（图3b）。通过三态转换模型拟合数据，得出光活化PEG-脂质和细胞膜相互作用的特征时间尺度分别为53秒和31秒，整个过程在大约300秒内达到饱和（图3c）。这表明细胞在可光活化表面的锚定在几分钟内即可快速完成。
3. 光诱导选择性单细胞分离
利用可光活化表面，研究成功实施了针对单个目标细胞的光诱导选择性锚定。以人外周血单个核细胞（PBMCs）为医学相关模型。在细胞悬浮液中，大约含有0.01%的绿色荧光染色细胞。通过共聚焦显微镜扫描整个基底表面，识别出染色细胞（图4a）。随后，在显微镜观察下，用聚焦光斑选择性照射染色细胞，再经PBS层流冲洗。结果显示，只有染色细胞被成功锚定并保留在原位，而周围未染色的细胞被迅速移除（图4b），从而实现了从紧密接触的高密度细胞群体中精确分离稀有目标血细胞。
研究还实现了多个感兴趣细胞的同步分离。将红色和绿色荧光染料标记的两组BaF3细胞混合，并以高密度接种。扫描后，对红色荧光标记的细胞进行选择性光斑照射（每个细胞照射4ms）。冲洗后，所有八个红色荧光标记的细胞均保留在表面，而绿色荧光标记的细胞则无残留（图4c, d）。在三组独立实验中，对27个目标细胞进行光照，其中24个被成功分离。该方法可实现单细胞和多细胞的同时分离，且操作快速、简单，对细胞无显著光损伤，并能保持细胞活性。尤为突出的是，该方法克服了传统方法（如毛细管微操纵、光镊、声镊、介电泳等）需在低密度条件下操作的局限性，实现了在超过常规密度极限一个数量级以上的细胞群中进行精确单细胞分离，使其特别适合于从大规模群体中分离稀有细胞。
4. 循环肿瘤细胞（CTCs）的分离
循环肿瘤细胞（CTCs）是进入血液的肿瘤衍生细胞，可作为癌症无创液体活检的关键生物标志物。为了满足可靠分离CTCs的需求，研究利用可光活化表面，展示了从外周血样本中分离CTCs的能力。实验从小鼠中采集血液样本，经过免疫荧光染色后，将其引入涂覆了可光活化PEG-脂质1的微通道。通过自动拼接扫描观察表面所有细胞（图5a）。在获取的65张图像中，在4张图像中识别出荧光标记的CTCs（图5c-f）。随后，用光斑选择性照射单个CTCs，其中一个图像中聚集的三个CTCs用更大光斑照射。PBS冲洗后，仅被照射的CTCs被选择性锚定保留，而未被照射的血细胞被移除（图5b, g-j）。这表明，临床重要的稀有细胞，如CTCs，可以通过该可光活化表面的原位光引导活化实现精确、高效的分离。
结论
本研究提出了一种基于可光活化表面的光诱导选择性单细胞分离方法。该方法结合用于目标检测的显微观察和用于选择性锚定的局域光辐照，能够快速、精确地锚定和回收目标细胞，甚至在细胞密度超过传统单细胞挑选方法十倍以上的高密度培养条件下也能实现。此能力对于极低频率存在的稀有细胞的检测和分离尤为有利，因为其回收需要能够快速筛选大量细胞群的高密度观测条件。此外，多个目标细胞可在短时间内被同时回收。该方法的准确性和效率归功于可光活化表面快速、稳健的细胞捕获能力与光刺激提供的亚细胞级分辨率控制和快速操控。通过先前的显微观察识别出的CTCs聚集体，被成功分离。基于此结果，该技术不仅有望应用于基于荧光的细胞筛选，也可用于基于更复杂表型（如形态学）的细胞筛选。总而言之，这种光响应表面是一种极具前景的生物医学应用工具，为高通量、高精度的单细胞操作开辟了新途径，有望革新医学研究中的单细胞分析和诊断。
