《Environmental Science: Advances》：Metastatic impact of perfluorooctanoic acid on liver cancer: insights from HepG2 cells and zebrafish xenograft models
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本文建立了一种利用斑马鱼-人源HepG2细胞移植瘤模型来评估全氟辛酸(PFOA)促肝癌转移效应的新方法。研究发现，环境暴露于PFOA能显著增强HepG2细胞在斑马鱼体内的增殖、迁移及转移标志物（E-钙黏蛋白-1（CDH1）和基质金属蛋白酶-9（MMP9））表达。机制研究表明，PFOA的致癌效应可能与激活芳香烃受体(AhR)通路有关。这项工作为PFAS化合物的致癌性评估提供了一个高效、可靠的in vivo高通量筛选平台。
文章内容归纳总结
引言
全氟和多氟烷基物质(PFASs)是一类广泛应用于消费品中的合成化学物质，因其防水防油特性而广为人知。其中，全氟辛酸(PFOA)作为一种典型的遗留性PFAS，越来越多地被发现与肝癌发生有关。肝细胞癌(HCC)是全球范围内一项重大的健康挑战，占原发性肝癌病例的约90%，其发病率的上升与丙型肝炎病毒、肥胖以及长期暴露于PFOA等环境毒素有关。因此，开发新的分子模型以更好地理解环境致癌物（如PFOA）的致癌机制和评估其风险至关重要。斑马鱼作为一种in vivo模型生物，因其与人类基因的高度同源性、胚胎透明便于观察、免疫系统发育较晚便于异种移植等优势，被广泛应用于人类肿瘤细胞的研究。本研究旨在开发一种人肝癌细胞（HepG2）斑马鱼移植瘤模型，以探究PFOA对肝细胞癌的致癌作用。
实验方法
研究中使用的斑马鱼实验均遵循相关机构指南。人源HepG2-Lucia? AhR细胞系（含有AhR荧光素酶报告系统）被培养后，用活细胞成像染料标记。在受精后一天（24 hpf）的斑马鱼胚胎中，将标记的细胞显微注射到卵黄囊区域。移植后，胚胎在30°C下培养，并逐渐升温至36°C以优化人细胞生长。然后，胚胎暴露于0.1、1.0和10 ppm浓度的PFOA中24至96小时。作为阳性对照，研究还使用了两种多环芳烃(PAH)化合物蒽和萘（0.1-1.0 ppm），这两种物质已知可通过激活AhR通路损伤肝细胞。
建立HepG2移植瘤模型
研究团队将HepG2-Lucia? AhR细胞注射到24 hpf的斑马鱼胚胎卵黄区域。通过每日观察，发现细胞在注射后24小时（1 dpi）就开始迁移，到3 dpi时，更多细胞出现在鱼体中后部，甚至在心脏腔中观察到细胞。到5 dpi时，细胞迁移到眼睛、背部等区域。为了量化体内的癌细胞数量，研究人员建立了一种基于qPCR的定量方法。通过将斑马鱼胚胎/幼鱼与已知数量的HepG2细胞混合，提取RNA并检测人源持家基因（如hprt1）的表达，绘制出标准曲线。结果显示，体内HepG2细胞数量在注射后迅速增加，从0 dpi的约500个/胚胎，增加到1 dpi的3768 ± 821个，5 dpi时达到14083 ± 5803个，表明细胞在体内积极增殖。
PFOA促进HepG2转移
为了评估PFOA的致癌效应，研究人员在HepG2细胞注射后48小时（72 hpf，此时胚胎已孵化）开始对斑马鱼幼鱼进行PFOA处理。结果显示，PFOA处理24小时后，所有剂量组均能促进HepG2细胞在体内的迁移，特别是在0.1 ppm处理组中，更多细胞出现在心脏腔和眼睛周围。细胞增殖则显示出剂量依赖性，其中10 ppm PFOA处理组的HepG2细胞数量（30716 ± 12705）显著高于未处理对照组（2732 ± 1011）。此外，研究人员还检测了两个转移标志基因cdh1（编码E-钙黏蛋白-1）和mmp9（编码基质金属蛋白酶-9）的表达变化。在PFOA应激下，cdh1的表达在1 dpt时下调，但在3 dpt时恢复，这种变化模式与肿瘤细胞迁移和定植过程中的上皮-间质转化(EMT)相符。而mmp9的表达则在1 dpt和3 dpt均持续上调，其中1 ppm和10 ppm PFOA处理组的mmp9表达量分别是对照组的11.19 ± 1.86倍和10.64 ± 2.38倍。MMP9是一种分解细胞外基质的酶，其持续上调与观察到的HepG2细胞在体内的持续迁移现象一致。
蒽和萘对HepG2细胞产生类似的转移效应
作为两种已知的AhR配体，蒽和萘也被用于处理斑马鱼移植瘤模型。研究发现，0.1 ppm和1 ppm的蒽处理均能促进体内HepG2细胞的增殖，0.1 ppm处理组的细胞数量（12133 ± 3086）显著高于对照组。此外，蒽处理也引起了与PFOA类似的转移标志基因表达模式：cdh1在1 dpt下调，3 dpt上调；mmp9则持续上调。同样，萘处理也增强了HepG2细胞的迁移，尤其是在0.1 ppm处理组，细胞更多地迁移到鱼体的中后部。0.1 ppm萘处理组的cdh1表达在1 dpt显著下调，在3 dpt则显著上调；而mmp9的表达在两个处理组中均在1 dpt就显著上调。
PFOA在体外和体内激活AhR通路
为了探究PFOA促转移的可能机制，研究检测了其是否激活AhR通路。使用含有AhR荧光素酶报告系统的HepG2细胞进行的体外实验表明，PFOA（0.1、1、10 ppm）处理能显著增加相对光单位(RLU)，表明其激活了AhR。这与两种已知的AhR激活剂蒽和萘的效果相似。PFOA本身不含芳香环结构，通常不被认为是AhR的直接配体，但研究指出，PFOA是过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)的激活剂，而AhR和PPAR通路在肝脏等器官中存在交互作用，这可能是PFOA间接激活AhR报告系统的原因。为了在更复杂的in vivo环境中验证这一发现，研究人员测量了含有移植瘤斑马鱼幼鱼培养水中的荧光素酶活性。结果证实，PFOA处理同样能在体内激活AhR通路，尽管其激活速度似乎比PAHs化合物更慢。
结论
本研究开发并优化了一种利用人HepG2-Lucia? AhR细胞系的斑马鱼移植瘤模型，用于评估PFOA的致癌效应。该模型被证明在评估HepG2细胞在体内的迁移、增殖和进展等行为方面是可靠的。研究发现，PFOA能显著诱导HepG2细胞的转移，包括增强细胞迁移、促进细胞增殖以及提升转移标志物的表达。通过该模型，研究还探讨了PFOA触发肝细胞癌的可能机制。利用HepG2细胞中的AhR荧光素酶报告系统，研究发现PFOA能够激活AhR通路，其效果与蒽和萘这两种PAH化合物相似。尽管PFOA的结构与AhR直接配体不符，但AhR与PPAR通路之间的交互作用可能是PFOA对肝细胞产生致癌作用的机制。这项研究为评估PFAS化合物的致癌性提供了一个可靠、高效的体内高通量筛选平台。
