玉米转录抑制因子ZmWRKY29通过抑制ZmRBOHC介导的ROS爆发削弱赤霉茎腐病抗性的机制解析

《Plant Biotechnology Journal》：ZmWRKY29 Transcriptionally Represses ZmRBOHC to Attenuate ROS Production and Facilitates Gibberella Stalk Rot Susceptibility in Maize

本文揭示了玉米对赤霉茎腐病（GSR）易感的新机制。研究发现，病原菌侵染诱导的转录因子ZmWRKY29通过直接结合并抑制两个呼吸爆发氧化酶同源物基因ZmRBOHA和ZmRBOHC的转录，从而削弱活性氧（ROS）的爆发和胼胝质沉积，最终导致玉米对赤霉病的易感性增强。这项研究不仅鉴定了一个关键的植物感病因子，也为通过调控ROS通路来增强作物抗病性的分子育种提供了新靶点。

　　

玉米转录抑制因子ZmWRKY29通过抑制ZmRBOHC介导的ROS爆发削弱赤霉茎腐病抗性的机制解析

引言

赤霉茎腐病（GSR）是由禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）引起的玉米毁灭性病害，严重威胁玉米生产，但其抗性分子机制尚不完全清楚。植物在应对病原体入侵时会产生一系列免疫反应，其中活性氧（ROS）的快速爆发是植物先天免疫的关键早期事件。这一过程主要由定位于细胞膜的呼吸爆发氧化酶同源物（RBOHs，又称NADPH氧化酶，NOXs）介导。在拟南芥中，AtRBOHD和AtRBOHF是免疫反应中ROS爆发的主要酶。在玉米中，ZmRBOHD被ZmBLK1磷酸化，参与了对玉米灰斑病的免疫反应。然而，RBOHs在玉米GSR抗性中的作用及其调控机制仍有待阐明。

本研究聚焦于转录因子ZmWRKY29，发现其在禾谷镰刀菌侵染后被诱导上调，并作为玉米对GSR抗性的负调控因子发挥作用。过表达ZmWRKY29会显著增加玉米对GSR的易感性，而敲除该基因则能增强抗性。进一步分析表明，ZmWRKY29能够抑制侵染后的ROS产生，并通过结合其启动子中的特定W-box来抑制ZmRBOHA和ZmRBOHC的转录。ZmRBOHC的功能缺失突变体同样表现出GSR抗性降低和ROS产生减弱。因此，本研究揭示了ZmWRKY29通过抑制ZmRBOHC介导的ROS产生，从而促进玉米对GSR易感性的新机制，为理解病原菌如何利用宿主转录机制抑制ROS防御并促进侵染提供了新见解。

结果

1. ZmWRKY29是受病原侵染诱导的转录抑制因子

进化树分析表明，ZmWRKY29属于Group IIe WRKY家族成员，在单子叶和双子叶植物成员间有明显分化。表达分析发现，ZmWRKY29在禾谷镰刀菌侵染后1小时就被快速诱导，并在后续时间点持续上调。水杨酸（SA）和茉莉酸（JA）处理也能诱导其表达。亚细胞定位显示ZmWRKY29-GFP融合蛋白定位于细胞核。转录活性分析表明，ZmWRKY29在酵母系统和玉米原生质体系统中均缺乏自激活活性，且当与转录激活结构域VP16融合时，能显著抑制VP16的转录激活活性，证明ZmWRKY29是一个转录抑制因子。

2. 过表达ZmWRKY29导致对禾谷镰刀菌的易感性增加

为探究ZmWRKY29在玉米抗病性中的功能，研究者构建了两个独立的ZmWRKY29过表达株系。在玉米幼苗茎秆接种禾谷镰刀菌菌丝4天后，过表达株系的病斑面积和相对真菌生物量均显著高于野生型。幼苗根部接种实验同样显示，过表达株系表现出更严重的病害症状和更高的真菌生物量。此外，在田间抽穗期对玉米茎秆进行孢子接种，7天后过表达株系的茎腐病斑长度也显著长于野生型。这些结果一致表明，ZmWRKY29是玉米对禾谷镰刀菌抗性的负调控因子。

3. 过表达ZmWRKY29减少ROS产生和胼胝质沉积

ROS爆发是植物对病原体侵染的重要反应。DAB染色显示，接种后野生型茎秆中形成更多指示H₂O₂积累的红棕色沉淀，而过表达株系染色较浅且菌丝更多，表明ROS积累减少。利用ROS敏感性荧光染料H₂DCFDA成像及H₂O₂含量检测，均证实过表达株系细胞内的ROS水平显著降低。几丁质诱导的ROS爆发实验也表明，过表达株系的ROS爆发反应明显减弱。此外，胼胝质沉积是植物应对生物胁迫的另一重要特征。接种后野生型茎秆在细胞连接处的胼胝质沉积显著多于过表达株系。以上结果说明，过表达ZmWRKY29削弱了ROS产生和胼胝质沉积，这可能是其导致对禾谷镰刀菌易感性增加的原因。

4. ZmWRKY29突变增强GSR抗性并促进ROS产生

为验证ZmWRKY29的功能，研究者获得了Mu转座子插入的ZmWRKY29突变体。幼苗茎秆和田间成熟茎秆接种实验均表明，突变体植株的病害症状、病斑面积/长度以及真菌生物量均显著低于野生型，表现出增强的GSR抗性。重要的是，突变体的几丁质诱导ROS爆发更强，DAB染色更深，H₂DCFDA荧光信号和H₂O₂含量也更高。这些结果从反面证实了ZmWRKY29作为GSR抗性负调控因子，能够削弱ROS产生。

5. ZmWRKY29抑制ZmRBOHA和ZmRBOHC的表达

为解析ZmWRKY29调控GSR抗性和ROS产生的分子机制，研究者对野生型和过表达株系接种后的茎秆进行了RNA-seq分析。结果显示，两个RBOH基因ZmRBOHA和ZmRBOHC在过表达株系中的表达水平在侵染前后均低于野生型。qPCR结果进一步证实了这一点。在不同玉米自交系中，ZmRBOHC和ZmWRKY29的表达呈显著负相关。在玉米原生质体中瞬时过表达ZmWRKY29也会导致ZmRBOHA和ZmRBOHC表达下调。这些结果表明，ZmRBOHA和ZmRBOHC可能是受ZmWRKY29转录抑制的靶基因。

6. ZmWRKY29直接结合ZmRBOHA和ZmRBOHC的启动子

通过双荧光素酶报告基因实验，发现ZmWRKY29能显著抑制ZmRBOHA和ZmRBOHC启动子的活性。对启动子进行系列缺失和位点定向突变分析发现，ZmWRKY29对ZmRBOHC启动子的抑制依赖于-128 bp处的W-box。DNA亲和纯化-qPCR分析显示，ZmWRKY29能直接结合到ZmRBOHA启动子多个含W-box的区域以及ZmRBOHC启动子的-128 bp W-box区域。电泳迁移率变动分析和酵母单杂交实验进一步在体外和体内证实了ZmWRKY29与这些W-box的直接结合。烟草叶片中的双荧光素酶成像实验也直观地展示了ZmWRKY29对这两个启动子的抑制效果。

7. ZmRBOHC负调控玉米对禾谷镰刀菌的抗性

为确定ZmWRKY29的靶基因ZmRBOHC是否在GSR抗性中发挥作用，研究者获得了EMS诱导的ZmRBOHC功能缺失突变体。该突变体在籽粒厚度、单穗粒重和百粒重等产量相关性状上略有增加。幼苗茎秆和田间成熟茎秆接种实验表明，ZmRBOHC突变体表现出更严重的病害症状、更大的病斑面积/长度。此外，突变体的几丁质诱导ROS爆发也明显减弱。这些数据证明，ZmRBOHC是GSR抗性的正调控因子。禾谷镰刀菌通过诱导并招募ZmWRKY29来靶向抑制ZmRBOHC的转录，从而减少ROS产生，促进宿主易感性。

讨论

本研究鉴定出ZmWRKY29作为一个感病因子，负调控玉米对GSR的抗性。其机制在于，病原菌侵染诱导ZmWRKY29表达，随后ZmWRKY29直接结合到ZmRBOHC启动子的W-box上抑制其转录，从而削弱了ZmRBOHC介导的ROS产生，最终促进了GSR的易感性。ROS爆发和胼胝质沉积都是植物模式触发免疫的关键反应。本研究发现ZmWRKY29过表达植株中胼胝质积累减少，这可能是ROS水平受影响的间接结果，也可能是ZmWRKY29直接调控了胼胝质合成相关基因，有待进一步研究。值得注意的是，ZmWRKY29的表达在病原菌侵染后被强烈上调，这提示病原菌可能利用宿主的转录机制来破坏ROS相关的免疫反应，这是其成功侵染的关键策略。

ROS的产生在植物先天免疫中受到精确调控。除了翻译后修饰可快速激活RBOH酶，转录控制提供了另一关键调控层面。本研究与前人的工作共同强调了WRKY转录因子作为跨物种RBOH基因关键转录调节因子的重要性，它们扮演着激活剂或抑制因子的双重角色。本研究的新发现在于，玉米ZmWRKY29作为ZmRBOHA和ZmRBOHC的转录抑制因子发挥作用，损害ROS产生并增强对禾谷镰刀菌的易感性，这为植物-病原体互作中WRKY-RBOH转录模块的多样性和重要性增添了新的维度。

除了在防御中的作用，ROS在生长、发育和非生物胁迫响应中也扮演着重要角色，这意味着操纵这些通路可能会产生多效性。本研究发现，尽管ZmRBOHC是水稻OsRBOHC的直系同源基因，且其突变同样降低了抗病性，但ZmRBOHC突变体在对照条件下表现出轻微但显著的产量增加。这种表型差异可能与表达模式不同有关。鉴于ZmRBOHC介导的质外体ROS产生也参与气孔关闭以增强抗旱性，其组成型表达可能以不同的方式影响玉米的发育过程。

在育种中利用像ZmWRKY29这样的感病基因前景广阔但具有挑战性，因为它们通常参与基本的生理过程。因此，其突变带来的抗性增强往往以产量或生长损失为代价。本研究中，ZmWRKY29突变植株表现出显著增强的GSR抗性。然而，在一个遗传背景中难以再生编辑愈伤组织，提示ZmWRKY29可能影响玉米生长。值得注意的是，我们获得的抗性突变体处于B73背景中，未知的遗传机制可能补偿了ZmWRKY29功能的缺失，这突显了遗传背景的影响。

为了潜在地克服抗性与生长的权衡，未来的策略可以侧重于微调而非消除ZmWRKY29的功能。这可能包括筛选具有较弱病原诱导表达的自然单倍型，或利用CRISPR/dCas9介导的转录调控来精确破坏其感染触发的上调。这种方法可能有助于开发出具有增强GSR抗性，同时将对农艺性状的负面影响降至最低的玉米品系，充分利用ZmWRKY29对ZmRBOHs介导的ROS产生的调控作用。

结论

本研究系统阐明了转录因子ZmWRKY29在调控玉米赤霉茎腐病抗性中的新机制。ZmWRKY29作为禾谷镰刀菌侵染诱导的转录抑制因子，通过直接结合并抑制ZmRBOHC（可能还包括ZmRBOHA）的转录，削弱了病原触发的ROS爆发和胼胝质沉积，从而降低了玉米的GSR抗性。这项工作不仅鉴定了一个关键的植物感病因子，揭示了病原菌劫持宿主转录机制以抑制免疫的新策略，也为通过精细调控ROS通路相关基因来平衡作物抗病性与农艺性状的分子设计育种提供了重要的理论依据和潜在靶点。