通过分子对接和分子动力学模拟解析表面活性剂对脂肪酶TpS9与pNPP相互作用的影响

《Journal of Environmental Chemical Engineering》：Decoding the impact of Surfactants on the interaction between Lipase TpS9 and pNPP through Molecular Docking and MD Simulations

TpS9脂肪酶在表面活性剂存在下对p-Nitrophenyl palmitate的催化机制研究，采用分子对接和MD模拟发现TX-100、Tween-80、Tween-20通过稳定活性口袋残基影响酶构象，增强底物结合能力，其中Tween-80效果最显著，为酯类废水生物处理提供新思路。

　　

赵宇涵|陈琳|段立新|王瑞格

齐齐哈尔大学化学与化学工程学院，中国齐齐哈尔161006

摘要

TpS9脂肪酶作为一种酯类水解的生物催化剂，在工业废水处理领域展现了高效且可持续的生物催化潜力。尽管表面活性剂会显著影响TpS9降解酯类污染物的活性，但其具体的相互作用机制仍不清楚。为了研究三种表面活性剂TX-100、Tween-80和Tween-20对TpS9与对硝基苯基棕榈酸酯（pNPP）相互作用的影响，进行了分子对接和分子动力学（MD）模拟。结果表明，在模拟过程中，这三种表面活性剂逐渐积聚在TpS9活性位点周围的残基附近，影响了其构象以及TpS9与pNPP之间的相互作用。自由能计算的结果进一步证实，所有表面活性剂都增强了TpS9与pNPP的结合能力，其中Tween-80的效果最为显著。这些结果为表面活性剂在TpS9处理含酯废水中的应用提供了新的思路。

引言

酯类化合物作为常见的污染物，广泛存在于食品加工、化妆品和制药等行业的工业废水中[1]、[2]、[3]。由于对硝基苯基棕榈酸酯（pNPP）的酯键结构与天然甘油三酯相似[4]、[5]（两者都含有16个碳原子），因此常被用作模拟酯类化合物以测试脂肪酶的活性[6]、[7]、[8]、[9]、[10]。此外，pNPP在临床胰腺功能筛查[11]、食品工业中酶制剂评估以及脂质代谢研究等领域也起着关键作用[12]、[13]。此外，pNPP还可作为生化研究工具，用于药物开发中的抑制剂筛选，以及化妆品和洗涤剂行业的质量控制过程[14]。目前，处理酯类化合物的常用方法包括化学水解、膜分离、高级氧化工艺（AOPs）和吸附-混凝[15]、[16]、[17]。然而，这些方法通常存在效率低、成本高和可能产生二次污染等局限性。相比之下，生物催化降解具有高效、环保和可持续性等显著优势，适用于环境治理和工业应用[18]、[19]。

脂肪酶（EC 3.1.1.3）作为α/β水解酶家族的关键成员，在处理含有酯类化合物的废水中起着重要作用，这归功于其独特的催化功能[20]、[21]。这类脂肪酶在动物、植物和微生物中普遍存在。其中，微生物中的脂肪酶因其生产成本低、易于大规模生产和广泛的底物特异性而受到关注[22]、[23]。从结构特征来看，脂肪酶具有保守的α/β折叠结构，其活性位点由Ser-His-Asp/Glu组成的催化三联体主导。该区域通过“盖子”结构调节底物与催化位点的结合，赋予其精确的催化选择性[24]。作为高效的生物催化剂，脂肪酶能够特异性识别并水解废水中的各种合成酯、天然酯和其他酯类化合物。脂肪酶将它们转化为醇和脂肪酸，这些物质更容易被微生物降解或通过其他方法去除[25]、[26]、[27]。多项研究证实了脂肪酶的应用潜力。2021年，任等人从高效降解脂质的细菌Klebsiella quasivariicola IUMR-B53中克隆并鉴定出一种新型脂肪酶，证实该脂肪酶对酯类化合物具有显著的降解活性[28]。2022年，Rmili等人从Staphylococcus capitis SH6中纯化出一种抗有机溶剂脂肪酶，并通过30℃下的失活酶降解实验验证了该脂肪酶能够有效降解酯类化合物[29]。然而，温度、pH值、溶剂组成、金属离子和表面活性剂等环境因素对脂肪酶的催化活性和稳定性有显著影响[30]。为了突破技术瓶颈并提高脂肪酶的应用效果，Akram等人利用基因工程技术从Thermotoga petrophila RKU-1T中提取了TpS9脂肪酶[4]。TpS9是一种单体蛋白，其活性位点属于肽酶S9prolyl寡肽酶，具有典型的α/β水解酶折叠结构，包含8个β-折叠片和6个α-螺旋。其催化三联体由丝氨酸（S160）、天冬氨酸（D196）和组氨酸（H246）组成，其中丝氨酸位于保守的五肽序列Gly-X-Ser-X-Gly（GLSAG）中。TpS9的底物结合口袋具有高度疏水和刚性的结构特征，使其对长链酰基酯（如pNPP）具有特异性亲和力。在结合过程中，底物的疏水长链通过疏水相互作用稳定下来，而酯基的氧原子与催化三联体核心位点Ser160的羟基形成氢键，精确引导酯键与亲核反应中心对齐，为高效的催化水解奠定了关键的结构基础。Akram等人的研究[4]进一步证实，TpS9对长链酰基酯具有显著的催化选择性，比活性高达3160 U·mg^-1，能够有效降解废水中的天然油脂并将其转化为长链酯类污染物。这一特性使其成为处理含有长链酯的畜牧业、肉类加工业、食品加工业和化学工业废水的高质量酶源。值得注意的是，纯化的TpS9具有良好的环境耐受性，对盐、洗涤剂、金属离子和有机溶剂等化学物质具有高稳定性，并且具有优异的热稳定性和pH稳定性，以及对长链烷基酰基酯的特异性亲和力。它是一种非常有前景的新型生物催化剂，适用于工业废水的处理。

作为典型的两亲分子，表面活性剂凭借其亲水性和疏水性基团的独特结构，能够显著降低液体的表面或界面张力，在许多领域发挥着关键作用[31]。在生化领域，表面活性剂与脂肪酶之间的相互作用极大地影响了它们的活性和功能。多项研究证实，表面活性剂可以显著促进脂肪酶的活性[32]。2020年，Goswami研究了非离子表面活性剂对多种脂肪酶催化性能的影响，发现Tween-20、Tween-80和Triton显著提高了脂肪酶的活性[33]。2000年，Liu等人研究了多种表面活性剂对Candida rugosa脂肪酶催化的酮洛芬酯水解的影响，表明Tween-80显著增强了脂肪酶的活性[34]。2024年，Akram等人通过实验研究了表面活性剂对TpS9活性的影响，证实TX-100、Tween-80和Tween-20都能促进TpS9的活性[4]。2025年，Zhang等人通过分子动力学（MD）模拟研究了表面活性剂TX-100通过甘油预处理对木质素结构的修饰作用，从而增强了酶的活性[35]。然而，在表面活性剂TX-100、Tween-80和Tween-20的作用下，TpS9与底物pNPP在原子层面的结合模式和相互作用机制仍不清楚。

分子动力学（MD）模拟对于探索表面活性剂在原子层面上的脂肪酶-底物相互作用至关重要[36]、[37]。此外，Shi等人利用MD模拟深入探讨了温度、压力和盐度对页岩干酪素润湿性的微观调控机制，证明了MD模拟的可靠性和有效性[38]。Lei等人系统回顾了表面活性剂、聚合物、离子和油相组分在化学驱油中的多维相互作用机制，进一步突显了该技术在表面活性剂相关研究中的普遍性[39]。Liu等人还通过MD模拟精确研究了表面活性剂类型对CO₂/页岩油体系相容性的影响。模拟结果与实验数据的偏差仅为2.98%，进一步证实了该技术在复杂多组分系统中的精确表征能力[40]。2023年，Li等人结合MM-PBSA能量计算使用MD模拟研究了两种表面活性剂对酶与环境污染物相互作用的影响，阐明了表面活性剂调节酶的局部构象和极性溶剂化自由能的分子机制，从而影响底物的降解效率[41]。2024年，Yao等人进一步利用MD模拟揭示了三种不同类型表面活性剂对酶与环境污染物结合的差异性调控作用，并确认了表面活性剂性质与酶-底物相互作用机制之间的相关性[42]。因此，在本研究中，采用了分子对接技术构建了脂肪酶TpS9和pNPP的复杂体系。随后分别引入了表面活性剂TX-100、Tween-80和Tween-20，构建了十二个不同的体系（表S1）。通过MD模拟结合能量分析的研究策略，系统地研究了这三种表面活性剂对TpS9与pNPP相互作用的详细影响。这些结果揭示了表面活性剂如何影响TpS9与pNPP之间的相互作用，为更好地降解环境中的酯类污染物提供了思路。

部分摘要

初始系统的制备

首先，从GenBank数据库中获取了脂肪酶TpS9的氨基酸序列（ID:ABQ47595.1）。利用SWISS-MODEL在线平台生成了TpS9的三维结构[44]。然后，使用PROCHECK在线工具验证了通过MD模拟优化的TpS9结构的质量[45]。从PubChem数据库中获取了pNPP的结构[46]。随后，使用AutoDock进行了TpS9与pNPP之间的分子对接

同源建模和分子对接的结果分析

TpS9的三维模型经过10 ns的MD模拟进行了优化（图S2A），最终选择的MD模拟结果作为TpS9的最终构象。通过Ramachandran图评估了TpS9结构的合理性，位于有利区域和允许区域的残基比例分别为92.6%和6.5%，这证实了TpS9模型的合理性（图S2C）。此外，

结论

本研究首次尝试利用分子对接和MD模拟深入探讨表面活性剂TX-100、Tween-80和Tween-20如何调节TpS9与其底物pNPP之间相互作用的原子级机制。它揭示了不同表面活性剂在调节酶构象和增强底物结合亲和力方面的不同作用。这项研究填补了现有实验研究的空白，这些研究仅展示了

资助

作者感谢黑龙江省教育委员会基本科研经费（145409430）的财政支持。

CRediT作者贡献声明

王瑞格：撰写 – 审稿与编辑、软件使用、项目管理。赵宇涵：撰写 – 原稿撰写、数据管理。段立新：方法学设计、实验研究、数据管理。陈琳：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、实验研究。

利益冲突声明

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