多组学分析揭示了三氯苯磷酸酯（tricresyl phosphate）和TiO?纳米颗粒对大型溞（Daphnia magna）的共同毒性作用机制

《Journal of Environmental Management》：Multi-omics analyses reveal combined toxic mechanisms of tricresyl phosphate and TiO 2 nanoparticle on Daphnia magna

浮游甲壳类动物联合毒性机制研究。纳米二氧化钛与磷酸三甲酚酯协同抑制大型溞生长，通过多组学技术揭示其通过改变肠道菌群结构、干扰氨基酸、核苷酸及碳水化合物代谢通路，并导致抗氧化系统受损的协同作用机制。

　　

徐进|陈晓飞|曹学松|肖正高|刘英林|王振宇

江南大学环境过程与污染控制研究所及环境与生态学院，中国无锡，214122

摘要

本研究探讨了三氯磷酸酯（TCP）和纳米二氧化钛（nano-TiO₂）对大型溞（Daphnia magna）的联合毒性和作用机制。结果表明，在50 μg/L的TCP浓度和500 μg/L的nano-TiO₂浓度下，分别使Daphnia magna的生长受到19.9%和8.38%的抑制（基于体长）。TCP与nano-TiO₂的联合暴露表现出协同效应，其生长抑制程度比单独暴露于TCP时高出14.64%。从机制上看：(1) TCP与nano-TiO₂的联合暴露显著改变了Daphnia magna的细菌群落结构；(2) 代谢组学分析显示，TCP与nano-TiO₂共同作用显著干扰了Daphnia magna的氨基酸代谢、核苷酸代谢和碳水化合物代谢途径；(3) 蛋白质组学分析表明，与单独暴露于TCP相比，TCP与nano-TiO₂联合暴露导致更多蛋白质（如核糖体蛋白、RNA结合蛋白和柠檬酸合成酶）的表达下调。此外，这种联合暴露还加剧了Daphnia magna的氧化损伤并破坏了其抗氧化防御系统。我们的发现表明，在评估新兴污染物时，应考虑纳米颗粒与TCP的联合毒性。

引言

三氯磷酸酯（TCP）是一种典型的有机磷酸酯（OPEs），广泛用作阻燃剂或增塑剂（Huang等人，2022；Yang等人，2024）。随着其生产和使用的增加，OPEs通过沉积、径流和废水排放进入水生环境（Dou和Wang，2023；Wang等人，2020），导致在自然水体和生物体内普遍存在（Gu等人，2023；Tao等人，2022；Wang等人，2023；Yang等人，2024）。例如，中国渤海中OPEs的平均浓度为3.6 μg/L，在河北省的河流中可高达19.9 μg/L（Ren等人，2019）。研究表明，受人类活动影响的河流和湖泊中的OPEs含量通常高于海水（Yan等人，2023）。此外，中国各污水处理厂（WWTP）出水中OPEs的浓度范围从0.1 μg/L到511.6 μg/L不等（Chen和Ma，2021）。特别是在乌干达维多利亚湖的五个海湾中，TCP的浓度达到了8.1 μg/L（Nantaba等人，2021）。对瑞典湖泊和沿海生态系统采集的水生生物样本的分析显示，多种物种（如Clupea harengus、Perca fluviatilis、Mytilus edulis和Salmo salar）体内含有TCP，其浓度范围为3.0至137.0 μg/kg（Sundkvist等人，2010）。Mata等人研究了七种OPEs在海洋贻贝Mytilus galloprovincialis中的生物累积情况，发现TCP的生物累积率最高（Mata等人，2022）。已有研究表明，TCP对包括藻类、甲壳类和鱼类在内的多种水生生物具有较高的生态风险（风险商数RQ > 1）（Nantaba等人，2021；Zhu等人，2022）。例如，暴露于1 mg/L以下的TCP会对虹鳟鱼的生长产生负面影响，表现出慢性中毒的迹象（Lassen和Lokke，1999）。斑马鱼在长期暴露于TCP后游动能力下降（Ren等人，2021），而暴露于0.2 mg/L TCP时其性激素平衡受到干扰（Liu等人，2012）。然而，关于TCP对水生生物生物影响的机制仍存在知识空白。

二氧化钛纳米颗粒（nano-TiO₂）是工程纳米材料领域中最重要的材料之一，具有优异的性能，如吸收紫外线、热稳定性和光催化活性（Noman等人，2019）。在生产和使用过程中，nano-TiO₂会通过废水排放或废物处理途径大量释放到环境中，尤其在水生生态系统中积累（Wu等人，2020）。全球范围内nano-TiO₂的环境浓度持续上升，某些地区的平均浓度高达1.65 mg/L（Shi等人，2016）。在污染严重的地区，当前nano-TiO₂的浓度约为0.5 mg/L，预计在未来十年内将上升至约1.0 mg/L（Lu等人，2021）。OPEs的存在与制造业和建筑业有关（如电子设备、涂层和建筑材料）（Lai等人，2019；Lee等人，2018），而这些行业也使用了nano-TiO₂（Armakovic等人，2023；Harish等人，2022）。nano-TiO₂和OPEs的使用可能导致这两种污染物的共存。由于nano-TiO₂具有较大的表面积与体积比、固有的不溶性和表面反应性，它容易与自然水环境中的其他污染物（如有机污染物）结合，从而改变它们的环境特性并影响其毒性效应（Naasz等人，2018；Sharma等人，2024；Wang等人，2024）。先前的研究表明，nano-TiO₂的存在可能会通过放大TPhP（一种OPEs）的积累来加剧神经元异常并干扰血清素系统功能，导致斑马鱼幼体的运动模式异常（Fan等人，2022）。有假设认为nano-TiO₂可能作为TCP的载体，影响生物体对TCP的吸收和生物利用度。同时，系统性地研究TCP单独及与nano-TiO₂联合对水生生物的毒性作用在当前的生态毒理学评估中仍较为缺乏。因此，迫切需要评估TCP和nano-TiO₂在水环境中的风险，并阐明污染物与水生生物之间相互作用的详细分子机制。

高通量“组学”技术目前被用作有效工具，用于探究各种生物对非生物胁迫的整体响应（Li等人，2019）。具体而言，16S rRNA测序是分析微生物群落的关键方法，可提供关于污染物引起的菌群失调及其对宿主健康潜在影响的重要见解（Lynch和Hsiao，2019）。代谢组学方法可以同时识别和量化代谢水平的改变，从而全面描绘应激反应的分子级联过程（Guijas等人，2018；Shang等人，2023）。此外，蛋白质组学结合分子对接技术可以提供关于受环境压力影响的蛋白质响应、结合和相互作用的重要信息（Li等人，2018）。尽管多组学方法已被用于研究nano-TiO₂和其他有机污染物的联合毒性，但将其应用于阐明nano-TiO₂与D. magna之间具体机制的研究仍不充分（Chen等人，2024；Sun等人，2024）。因此，运用微生物群分析、非靶向代谢组学和非靶向蛋白质组学对于揭示nano-TiO₂ + TCP引起的毒性机制至关重要，同时提供全面和多维的风险评估。

大型溞（Daphnia magna

）是一种浮游枝角类动物，也是Daphnia属中最大的物种，是研究生态毒理学的理想模型生物（Miner等人，2012）。我们选择D. magna作为测试生物，以评估nano-TiO₂和TCP的毒性效应。本研究旨在：(1) 评估nano-TiO₂和TCP对D. magna的联合毒性效应；(2) 分析D. magna体内微生物群落结构的变化；(3) 通过整合蛋白质组学和代谢组学分析来阐明关键代谢途径和潜在生物标志物。此外，还应用分子对接计算来说明特定蛋白质与TCP之间的相互作用机制。我们希望这些发现能为评估TCP及其与nano-TiO₂混合物的环境风险提供有价值的见解。

化学品和试剂

纳米二氧化钛（nano-TiO₂，粒径25 nm，锐钛矿型）和TCP购自Sigma Aldrich（美国）。TCP储备溶液（100 g/L）配制在甲醇中并冷藏（4°C）。nano-TiO₂储备悬浮液（1 g/L）在超纯水中超声处理（30分钟）以实现分散。随后将nano-TiO₂和TCP的储备溶液稀释至各实验所需的浓度。通过透射电子显微镜（TEM）分析了平均粒径和形态特征。

nano-TiO₂的特性分析

通过TEM观察了nano-TiO₂的形态特征。TEM图像（图S1）显示，nano-TiO₂的粒径约为20–48 nm，并且在SM7培养基中倾向于聚集形成团簇。Malvern粒度仪通过动态光散射（DLS）分析和Zeta电位测定了nano-TiO₂的流体动力学尺寸分布。nano-TiO₂的流体动力学直径为566 ± 87.56 nm，Zeta电位为?5.20 mV。

nano-TiO₂和TCP对D. magna的急性/慢性毒性评估

未观察到显著的不稳定性

结论

本研究表明，在环境相关浓度下，nano-TiO₂和TCP的联合暴露对D. magna的生长抑制作用比单独暴露于TCP更为严重。联合暴露破坏了D. magna体内的微生物群落组成，并干扰了关键的代谢途径，包括氨基酸代谢、碳水化合物代谢和核苷酸代谢相关代谢物及蛋白质的表达下调。分子对接分析证实TCP能够调节这些过程

CRediT作者贡献声明

徐进：撰写初稿、实验设计、数据管理。陈晓飞：数据可视化、正式分析、数据管理。曹学松：撰写、审稿与编辑、资金申请、正式分析。肖正高：监督、资金申请、正式分析。刘英林：资金申请、正式分析、概念构思。王振宇：撰写、审稿与编辑、资金申请、概念构思。

环境意义

三氯磷酸酯（TCP）和二氧化钛纳米颗粒（nano-TiO₂在自然水生环境中广泛存在。本研究表明，在环境相关浓度下，TCP和nano-TiO₂的联合暴露对Daphnia magna表现出协同毒性。通过多组学方法（包括微生物组学、代谢组学和蛋白质组学）分析了相关机制。基于环境相关条件，研究结果表明，这两种物质的联合效应...

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了中国自然科学基金（42192574、42377222）、江苏省基础研究计划（BK20243048、BK20240206、BK20230658）、无锡太湖人才计划（2024271）以及中央高校基本科研业务费（JUSRP202504022）的支持。