《Journal of Hazardous Materials》：T-2 Toxin Induces ER Stress-Dependent Liver Injury via mitophagy-mediated ER-phagy suppression: Berbamine Blocks SNARE Complex for Hepatoprotection
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本研究揭示了T-2毒素通过激活PINK1/Parkin介导的线粒体自噬抑制Keap1介导的FAM134B泛素化依赖性内质网自噬，引发内质网应激，导致肝损伤。berbamine通过上调并稳定BNIP3，阻断VAMP8-SNAP29相互作用，抑制自噬和内质网应激，从而显著减轻小鼠肝损伤，降低血清ALT和AST水平。
强旭|邓璐宇|徐金涛|吴志凯|林如勤|邓一坤|文志凯
华南农业大学畜禽育种产业国家重点实验室，中国广东省广州市510642
摘要
T-2毒素是一种持久性、具有生物累积性的环境污染物，对人类和动物构成重大健康威胁。内质网（ER）应激和自噬是维持细胞稳态的两个相互关联的应激反应。小檗胺（BBM）是一种重要的双苯基异喹啉生物碱，具有多种生物活性。本研究旨在确定BBM针对T-2毒素诱导的肝毒性的分子靶点，重点关注自噬与ER应激之间的相互作用。我们使用免疫印迹、透射电子显微镜和自噬报告基因检测方法系统评估了HepaRG细胞中的自噬和ER应激情况。研究发现，T-2毒素同时激活了PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，并抑制了Keap1介导的FAM134B泛素化依赖的ER自噬，从而引发ER应激。分子动力学和Western blot的结果表明，BBM上调并稳定了BNIP3蛋白，阻断了VAMP8-SNAP29的相互作用，从而抑制了T-2毒素诱导的自噬和随后的ER应激。此外，在小鼠体内的实验显示，30 mg/kg的BBM通过抑制自噬通量和ER应激显著减轻了T-2毒素引起的肝损伤；BBM还显著降低了血清中的肝酶ALT和AST水平。总体而言，我们的发现揭示了一种新的机制：T-2毒素诱导的线粒体自噬抑制了ER自噬，进而导致ER应激介导的肝损伤，突显了BBM在缓解T-2毒素诱导的肝损伤方面的治疗潜力。
引言
霉菌毒素是由多种真菌自然产生的一类次生代谢产物[1]。在麦角菌素中，T-2毒素因其广泛存在和高毒性而尤为引人注目。T-2毒素的亲脂性使其能够迅速通过胃、皮肤和肺部的黏膜被吸收[2]。由于肝脏在解毒过程中起着关键作用，因此成为T-2毒素的主要靶器官。T-2毒素通过氧化应激破坏正常人肝细胞（HL-7702）中的线粒体动态，从而引发细胞凋亡[3]。先前的研究表明，T-2毒素引起的脂质代谢紊乱会损害猪肝细胞中的活性氧（ROS）清除能力[4]。然而，T-2毒素引发肝细胞损伤的精确分子机制仍不清楚。
作为最危险的A型麦角菌素和主要的Fusarium次生代谢产物，T-2毒素是一种广泛存在的环境污染物，严重污染了全球的农作物、动物饲料和水源[5]。T-2毒素的产生受多种因素影响，如水分活性、温度和底物类型：由于收获前温度低且潮湿，被Fusarium污染的谷物在储存条件不当（如温带（20°C）和潮湿环境中）会进一步积累T-2毒素[6]。Biomin的全球霉菌毒素报告显示，T-2毒素的检出率显著上升（从23%增加到38%）[7]。在欧洲，大约60-70%的作物样本受到霉菌毒素污染，其中北欧和东欧的饲料及饲料原料样本中T-2毒素的检出率分别为30.3%和48.2%。2021年在亚洲，从75个国家收集的玉米样本中有22%检测出T-2毒素，其他谷物的检出率高达34%[8]。一项关于工人霉菌毒素暴露风险的研究显示，阿尔及利亚工人尿液样本中T-2毒素的检出率为92.7%，城市地区的检出率（98.8%）明显高于农村地区（69.2%）[9]。因此，加强T-2毒素的监测并阐明其致病机制具有重要的公共卫生意义。
自噬是一种由溶酶体调控的分解代谢途径，对维持各种细胞器的数量和完整性至关重要[10]。线粒体自噬（mitophagy）和网状自噬（ER-phagy）是两种研究最深入的细胞器特异性自噬形式，它们具有不同的启动机制和调控模式[11]、[12]。关于T-2毒素诱导的肝细胞自噬的研究有限：吴首次在人肝细胞（L02）中观察到自噬现象，随后在暴露于T-2毒素的鸡肝中也观察到了自噬激活[13]、[14]。越来越多的证据表明ER应激与自噬之间存在密切联系。一项研究显示，ER应激后自噬的启动是由PERK-eIF2α途径驱动的[15]。另一项研究表明，SARS-CoV-2的ORF3a可以激活ER自噬，进而引发ER应激[16]。然而，T-2毒素诱导的肝毒性中自噬与ER应激之间相互作用的分子机制仍不清楚。
鉴于T-2毒素对人类和动物的严重肝毒性，以及目前缺乏有效的解毒剂，寻找能够拮抗其肝毒性的天然化合物具有重要的公共卫生意义。从小檗植物Berberis amurensis中提取的双苯基异喹啉生物碱小檗胺（BBM）已被用于治疗炎症性疾病和白细胞减少症[17]。新证据表明，BBM通过切割埃博拉病毒糖蛋白GPcl来抑制病毒颗粒与细胞膜的融合及后续的内化过程，从而表现出显著的抗病毒活性。此外，BBM通过抑制内溶酶体运输来抑制SARS-CoV-2感染[18]、[19]。最新研究显示，BBM作为自噬抑制剂可以抑制SARS-CoV-2的复制[20]。然而，BBM作为自噬抑制剂对抗T-2毒素诱导的肝毒性的治疗效果和机制仍需进一步阐明。
本研究采用体内（小鼠）和体外（HepaRG细胞）相结合的方法，探讨了T-2毒素诱导的肝毒性中自噬与ER应激之间的相互作用，并研究了自噬抑制剂BBM的保护作用。我们的发现揭示了T-2毒素依次引发线粒体自噬、ER自噬和ER应激的独特机制，为T-2毒素的治疗和药物开发提供了新的见解。
细胞培养
从美国类型培养物收集中心（ATCC）获得的人类肝细胞HepaRG细胞在RPMI 1640培养基（Servicebio，武汉）中培养，培养基中添加了10%的胎牛血清（FBS，ExCell Bio，乌拉圭），培养条件为37°C和5%的CO?环境。同样来自ATCC的人类胚胎肾细胞系HEK293T在Gibco的Dulbecco改良Eagle培养基（Thermo Fisher Scientific，美国）中培养，培养基中也含有10%的胎牛血清。
抗体和试剂
本文使用的主要抗体如下：SQSTM1/P62
T-2毒素在肝细胞中诱导线粒体自噬和ER应激，但不诱导ER自噬
我们首先证明，用不同浓度的T-2毒素处理人类肝细胞HepaRG 12小时后，细胞活力呈浓度依赖性下降（图1A）。通过检测自噬标志物LC3-II和SQSTM1/p62在不同时间点的表达情况，发现T-2毒素显著降低了它们的表达水平（图1B），这一结果与先前的研究一致[23]。为了进一步研究T-2毒素处理下的自噬体形成或自噬通量，我们构建了一个稳定的细胞系
讨论
全球变暖和气候变化加剧了由霉菌毒素引起的人类和动物的健康问题。一项关于饲料中霉菌毒素分布的十年全球调查显示，气候和天气是污染的主要因素，高降雨量使欧洲成为T-2毒素污染最严重的地区[27]。历史上多次T-2毒素爆发事件包括20世纪的饮食性白细胞减少症（ATA）以及俄罗斯村庄的中毒事件
结论
总之，我们发现T-2毒素通过劫持PINK1/Parkin依赖的线粒体自噬来抑制Keap1介导的FAM134B泛素化依赖的ER自噬，进而引发ER应激，最终导致肝损伤。此外，BBM通过与SNARE复合蛋白SNAP29结合，竞争性地阻断BNIP3，从而减轻了T-2毒素诱导的自噬通量和随后的ER应激。小鼠体内的实验表明，BBM对T-2毒素引起的损伤具有强大的保护作用
环境影响
T-2毒素是一种广泛存在的环境污染物，污染了农作物、饲料和水源。当人体或动物摄入这种亲脂性、具有生物累积性的霉菌毒素时，会引发多种毒性反应。尽管肝脏是T-2毒素的主要解毒器官，但其引发肝损伤的机制尚未完全阐明，目前也没有有效的解毒剂。我们的研究旨在阐明T-2毒素如何通过劫持线粒体自噬来诱导肝损伤
作者贡献声明
文志凯：项目管理和资金筹集。邓璐宇：方法学设计和实验实施。强旭：写作、审稿与编辑、初稿撰写、数据分析。吴志凯：数据管理。徐金涛：软件使用和数据管理。邓一坤：资金筹集和概念构思。林如勤：实验监督和资金筹集。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金（U23A20240）、中国国家自然科学基金（32573426）、广东省基础与应用基础研究基金（2022B1515130003, 2024A1515012252）、中国国家重点研发计划（2023YFD1301002）以及广东省农业科学院现代种业创新能力提升项目的联合支持。
