在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中直接进化并表达Tfcut-B3基因，以实现商用PBAT基塑料薄膜的高效降解

《Journal of Hazardous Materials》：Direct evolution and expression of Tfcut-B3 in Bacillus subtilis for efficient depolymerization of commercial PBAT-based plastics films

PBAT塑料酶解效率提升及工业应用研究：通过定向进化获得高稳定性突变酶Tfcut-B3，可48小时内完全降解8/10种商业PBAT薄膜，降解效率较前代酶提升2.0倍，并实现枯草芽孢杆菌高效分泌，为规模化回收利用奠定基础。

　　

张明亮|丁芳慧|肖曦|程明根|洪青|严欣

中国农业部农业环境微生物学重点实验室，南京农业大学生命科学学院，江苏省南京市，中国

摘要

酶促解聚是一种潜在的高效且环保的聚（丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸乙二醇酯）（PBAT）废弃物回收和利用方法。然而，目前报道的解聚酶对多种实际商业PBAT薄膜的解聚能力仍不明确，这阻碍了对其实用性的准确评估。在本研究中，通过定向进化Tfcut-DM获得了具有增强热稳定性和提高活性的突变PBAT解聚酶Tfcut-B3。Tfcut-B3能够在48小时内完全将PBAT白色薄膜解聚为对苯二甲酸（TPA），其产TPA的量分别是Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)的2.0倍和1.3倍。Tfcut-B3还能在48小时内完全将8种商业PBAT基薄膜降解为TPA，而剩余的两种（PB-6和PM-4）仅被分解成小片段；Tfcut-DM则无法完全降解任何一种薄膜。通过染色体整合技术实现了Tfcut-B3在枯草芽孢杆菌中的过表达和胞外分泌；在摇瓶发酵中，通过优化启动子和宿主，Tfcut-B3的表达水平达到了274 mg/L。Tfcut-B3的发酵上清液在72°C下，20毫升体系中可完全降解高达64.9毫克的PBAT白色薄膜。这些发现为PBAT解聚酶的大规模应用提供了理论基础。

引言

聚（丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸乙二醇酯）（PBAT）是最常见的可生物降解塑料之一[1]。这种共聚物是由1,4-丁二醇（BDO）、己二酸（AA）和对苯二甲酸（TPA）通过缩聚反应合成的，形成一种脂肪族-芳香族聚酯[2]。由于其优异的机械性能和独特的阻隔特性（如低水蒸气渗透性），PBAT被广泛用于食品包装、农业和食品服务行业[3]、[4]、[5]。基于PBAT的覆盖膜可用于改善土壤条件并提高作物产量[3]，并且常用于购物袋和各种包装应用[4]。尽管PBAT在自然环境中可降解，但其自身的生物降解速率较慢[6]；加上其生产和消费量的迅速增加，导致PBAT废弃物大量积累[7]、[8]，这对环境构成了重大挑战，亟需有效的废物管理策略来减轻其环境影响并促进可持续利用。加强回收工作可以减少废弃物积累、节约资源，并降低生产新塑料所产生的碳足迹。实施先进的回收技术和推广循环经济原则是实现PBAT可持续管理、确保这种环保材料长期可行性的关键步骤。

酶促降解是一种有前景且环保的解决方案，受到了越来越多的关注[9]、[10]、[11]、[12]、[13]、[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]。来自Thermobifida fusca的工程化角质酶变体Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)在PBAT降解方面表现出显著潜力，分别能在36小时和24小时内实现PBAT薄膜的完全解聚[17]、[21]。同样，来自Alternaria alternata FB1的角质酶变体AaCut10^L209A/L216F能在48小时内完全降解PBAT薄膜[18]，而工程化角质酶变体LCC-M1和DCTPC_4M_S122H则分别能在4小时和6小时内完全降解PBAT薄膜[19]、[20]。这些发现凸显了酶促PBAT降解的巨大工业潜力，有助于推动更可持续的废物管理实践。

目前，商业PBAT基塑料产品主要是复合材料，通常通过将PBAT与其他物质（如碳酸钙和滑石粉）混合，或结合成本效益高的天然聚合物（如淀粉、木质素和纤维素）以及可生物降解的聚合物（如聚乳酸（PLA）和聚丁酸丁二醇酯）来制备[22]、[23]、[24]、[25]。然而，目前报道的PBAT解聚酶对这些产品的降解能力尚未得到评估。Tfcut-DM、AaCut10^L209A/L216F和DCTPC_4M_S122H主要在PBAT覆盖膜上进行了测试，而LCC-M1则在PBAT覆盖膜和PBAT/PLA混合物制成的商业袋上进行了评估[17]、[18]、[19]、[20]。由于这些先前的研究仅限于一两种商业产品，这些酶对实际PBAT塑料的广泛适用性仍不清楚。

在本研究中，通过定向进化Tfcut-DM获得了具有增强热稳定性和酶催化活性的突变体Tfcut-B3。评估了Tfcut-B3对十种商业PBAT基产品的解聚能力。通过染色体整合技术在枯草芽孢杆菌中实现了Tfcut-B3的胞外分泌，其发酵上清液可直接用于PBAT的解聚。这些结果表明，在现有发酵设施中直接应用PBAT水解酶是可行的，这对于推进PBAT的生物降解和回收具有重要意义。

化学物质和菌株

p-硝基苯酚乙酸酯（pNPA）、p-硝基苯基棕榈酸酯（pNPP）和对苯二甲酸（TPA）购自Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.（中国上海）。Zeocin（Zeo）和spectinomycin（Spc）购自Sangon Biotech Co., Ltd.（中国上海）。PBAT白色覆盖膜（厚度：0.008毫米）购自上海Hongrui Biotechnology Co., Ltd.（中国上海），其脂肪族（丁酸丁二醇酯）与芳香族（对苯二甲酸乙二醇酯）单元的摩尔比约为53:47。

突变体Tfcut-B3的定向进化与功能表征

为了通过定向进化提高Tfcut-DM对PBAT的催化活性，开发了一种高通量筛选方法以快速识别Tfcut-DM突变体（图S1A）。该方法利用了PBAT作为不溶性大分子聚合物无法进入微生物细胞的特点，而枯草芽孢杆菌可以利用信号肽将解聚酶分泌到细胞外。产生能够降解PBAT的活性突变酶的菌落会形成明显的晕圈，从而实现快速可视化检测。

结论

本研究鉴定出一种具有增强热稳定性和PBAT降解活性的突变酶Tfcut-B3。Tfcut-B3的性能优于之前的变体（Tfcut-DM和Tfcut-DM(Q132Y)，能在48小时内完全降解8种商业PBAT产品。相比之下，PB-6和PM-4的降解效果较差，这归因于它们的厚度以及PLA和淀粉等添加剂的存在。通过

环境影响

聚（丁酸丁二醇酯-对苯二甲酸乙二醇酯）（PBAT）作为一种常见的可生物降解塑料，由于其缓慢的环境降解速率而成为废弃物。本研究通过工程化Tfcut-B3（一种高效的解聚酶）提供了一种绿色的酶促回收解决方案，该酶能将多种商业PBAT薄膜降解为可再利用的单体。Tfcut-B3可通过微生物发酵大规模生产，其培养上清液可直接用于降解PBAT薄膜，为PBAT的管理提供了实际基础。

CRediT作者贡献声明

丁芳慧：资源提供、数据分析。 张明亮：初稿撰写、研究设计、数据分析。 肖曦：数据分析。 洪青：撰写、审稿与编辑、监督。 程明根：监督、方法学设计。 严欣：撰写、审稿与编辑、项目管理、资金争取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家重点研发计划（2024YFD1701002）和中国国家自然科学基金（32270127、32170126、32400085）的财政支持。