《Advanced Science》：Glutamine Deprivation Triggers Tribbles Homolog 3 Dependent G-Quadruplex Resolution to Maintain DNA Repair and Tumor Survival
文章内容归纳总结
1 引言
肝细胞癌(HCC)是全球主要的肝癌类型，多数患者确诊时已为晚期，治疗选择有限。肿瘤细胞通过代谢重编程适应肿瘤微环境(TME)中的营养匮乏等挑战。谷氨酰胺(Gln)是循环中最丰富的氨基酸，对肿瘤生存至关重要，其依赖现象被称为“谷氨酰胺成瘾”。然而，由于巨大的需求和功能失调的血管系统，肿瘤常面临Gln短缺。为了维持增殖，Gln成瘾的细胞会激活代偿途径，如自噬、Gln非依赖的回补反应、巨胞饮介导的氨基酸清除以及脂肪酸/乳酸利用。这些适应机制创造了可被治疗利用的代谢依赖性。
Gln作为核心代谢底物，为三羧酸(TCA)循环提供碳源，为能量和核苷酸前体供能，同时为从头生物合成提供氮源，从而支持基因组维持和高效的DNA复制。更重要的是，Gln还通过作为主要抗氧化剂谷胱甘肽(GSH)合成的主要前体并驱动NADPH产生以回收氧化的GSH，从而维持氧化还原稳态。Gln不足的状态会通过损害脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)供应和破坏氧化还原控制而触发氧化性DNA损伤，从而危及基因组完整性。尽管人们努力通过Gln摄取(如V9302)或代谢(如CB-839)的抑制剂来靶向这一脆弱性，但这些药物在临床试验中疗效有限。这种耐药性凸显了我们对驱动Gln成瘾肿瘤代谢适应性的动态机制理解有限。
本研究的重点是Tribbles伪激酶家族第三成员TRIB3。目前证据表明TRIB蛋白作为分子支架发挥作用，通过蛋白质-蛋白质相互作用产生影响。例如，TRIB3与PPARγ物理相互作用并抑制其转录活性，而TRIB3通过与USP10偶联促进SSRP1去泛素化从而稳定SSRP1。TRIB3在癌症中的初步表征显示其在正常组织中局限于肝脏，但在包括HCC在内的不同癌种中异常上调。此外，HCC细胞模型中的功能研究暗示TRIB3与索拉非尼耐药有关，最近的研究发现这种耐药是由活性氧(ROS)介导的内质网(ER)应激和未折叠蛋白反应(UPR)激活触发的。事实上，TRIB3通常被多种应激反应通路诱导，包括缺氧、内质网应激、营养限制(氨基酸、葡萄糖和脂肪酸剥夺)以及炎症。TRIB3作为分子开关，在整合应激信号下游协调环境依赖性的细胞命运决定，平衡适应性生存和死亡通路。
本研究发现了TRIB3通过其在解决Gln应激诱导的G-四链体DNA(G4)结构中的作用，成为了基因组稳定性的新守护者。这些通过鸟嘌呤碱基之间的Hoogsteen氢键形成的平面核酸基序，在基因组中含量丰富，在生理条件下具有重要的调节功能。然而，当病理性稳定时，G4结构会破坏关键的细胞过程，诱导DNA损伤，干扰必需的蛋白质-DNA相互作用(包括RNA聚合酶结合)，并阻碍转录和复制。我们发现，在Gln剥夺下，上调的TRIB3募集DEAD-box解旋酶5(DDX5)来解旋G4结构，同时促进DNA修复机器的转录激活，从而确保DNA损伤的及时解决和基因组完整性的维持。破坏Gln剥夺条件下的这一通路会加剧HCC细胞的DNA损伤并诱导细胞凋亡，这为与现有Gln摄取和代谢抑制剂进行联合治疗提供了可被利用的代谢脆弱性。
2 结果
2.1 Gln剥夺触发急性DNA损伤但在癌细胞中引发适应性修复反应
为明确Gln匮乏如何影响基因组稳定性，我们监测了Gln成瘾的HepG2 HCC细胞中DNA损伤和修复的时间动态。使用DNA双链断裂(DSBs)标志物γ-H2A.X (p-Ser139)的Western印迹分析，我们观察到在Gln剥夺12-18小时内DSB水平增加，随后在24小时下降。通过针对γ-H2A.X的免疫荧光染色获得一致结果，而碱性彗星实验显示，由增加的彗尾频率所显示的明显DNA断裂在Gln剥夺后24小时基本得到解决。这些结果共同反映了Gln匮乏与基因组维持之间的时间分辨相互作用，其中急性代谢应激诱导了可修复的DSBs。
之前的研究表明Gln缺乏会诱导氧化应激和DNA损伤。为了验证氧化应激，我们通过流式细胞术测量了Gln剥夺的HepG2细胞中的ROS水平，观察到在24小时内持续增加。用核H2O2探针HyPer7对Gln剥夺的HepG2细胞进行的进一步活体成像显示，在24小时内HyPer7激发比(Ex500/Ex400)逐渐增加，表明核H2O2持续积累。值得注意的是，持续的氧化应激与在24小时观察到的有效DNA损伤修复(DDR)形成对比。由于Gln是GSH合成的关键前体，我们监测了这种关键抗氧化剂及其生物合成前体。作为从头GSH合成的直接底物的谷氨酸(Glu)的细胞内水平急剧下降，并在Gln剥夺约8小时后几乎耗尽，证实了底物不足。尽管如此，GSH水平下降更为缓慢，在24小时内下降不到50%。这种部分维持可能反映了预先存在的GSH库的缓冲能力和通过GSH还原酶对氧化型GSH的再循环，即使在从头合成受限时也能暂时维持GSH水平。虽然到24小时观察到GSH的部分恢复，但这种有限的恢复——受Glu耗竭的限制——不足以有效抵消ROS的持续积累。然而，在此期间DNA修复机制被积极激活，如同源重组(HR)活性增加所证明的那样。
这些结果共同提出，Gln剥夺的HepG2细胞通过部分GSH恢复和ROS非依赖的DNA修复激活来适应慢性氧化应激，揭示了一种优先的基因组稳定化反应。这种矛盾的适应促使我们研究协调这些效应的分子介质。
2.2 TRIB3在Gln剥夺反应中快速上调并富集于细胞核，且与不良临床预后相关
为了确定Gln剥夺反应的介质，我们在12小时和24小时对HepG2细胞进行了RNA测序(RNA-seq)，并将这些数据与之前的48小时数据集整合，以鉴定在所有时间点一致的61个差异表达基因(DEG)。对61个一致DEG的Reactome通路富集分析揭示了与细胞对应激、刺激、饥饿的反应以及UPR相关的通路显著富集。
我们聚焦于“细胞对饥饿反应”通路中检索到的五个DEG，即ASNS、TRIB3、DDIT3、SESN2和CEBPB，发现TRIB3、DDIT3和SESN2上调，CEBPB下调，ASNS在Gln撤除反应中无变化。在这些基因中，只有TRIB3在肝脏肝细胞癌(LIHC)中与正常肝组织相比显著过表达。此外，Kaplan-Meier生存分析显示，肿瘤TRIB3表达较高的患者中位总生存期为31.0个月，而表达较低的患者为81.9个月。同样，较高的TRIB3表达也预示着更差的复发无生存期(RFS)。在应激反应基因中，TRIB3因其在LIHC中显著过表达以及与不良生存结果最强的关联而被优先用于进一步研究。
追踪HepG2细胞在Gln剥夺后TRIB3上调的动力学显示，其mRNA水平在3小时内增加，在剥夺约12小时后达到约6倍的峰值。这些发现在蛋白质水平上得到反映，在HepG2和Huh7细胞中观察到TRIB3的强劲且持续增加。此外，由于已知TRIB蛋白表现出动态和环境依赖的定位，我们考虑了Gln剥夺后TRIB3的细胞定位位点。亚细胞分级分离结合免疫荧光染色显示，TRIB3在Gln剥夺后主要定位于细胞核。
这些结果表明，Gln剥夺触发HCC细胞中TRIB3的快速核积累，临床数据暗示其过表达与HCC不良预后相关。
2.3 c-Jun驱动Gln剥夺期间TRIB3的转录上调
由于TRIB3上调主要是一种转录反应，我们使用整合转录因子靶点查找器平台来识别潜在的转录调节因子。来自六种预测算法的共同输出确定了三个候选转录因子，其中JUN沉默而非MYC或TFAP2C，在基础条件下显著下调TRIB3表达。此外，JUN沉默有效废除了Gln饥饿下的TRIB3上调。
为了识别TRIB3近端启动子中的c-Jun特异性基序，对JASPAR数据库的查询确定了两个假定的结合位点P1和P2。对公开可用的ENCODE HepG2 ChIP-seq数据的分析显示，在基础(Gln充足)条件下，P1和P2区域的c-Jun占据极少，这与观察到的低基础TRIB3表达一致。然而，使用包含单个c-Jun结合位点的pGL3载体的荧光素酶报告基因实验表明，在HEK 293T和HepG2细胞中进行的实验中，P1和P2片段都对异位c-Jun表达具有转录反应性。值得注意的是，在Gln剥夺下，内源性ChIP实验证明c-Jun优先结合TRIB3的P1启动子位点，表明c-Jun对TRIB3启动子的募集是应激诱导的而非组成性的。这些结果确定JUN介导的TRIB3转录激活是通过应激诱导性结合到P1启动子元件发生的，而非组成性占据。
最后，与氧化应激激活c-Jun信号通路的既定证据一致，我们发现H2O2处理激活了HepG2细胞中的该通路，该效应可被抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)阻断。这种氧化挑战也增加了γ-H2A.X和TRIB3的水平，而两者均被NAC减弱，这证实了TRIB3上调是ROS依赖性的。虽然急性H2O2诱导了TRIB3，但其诱导幅度小于Gln剥夺下，这表明额外的Gln敏感机制可能与氧化应激协同作用以实现完全的TRIB3上调。
总的来说，这些结果确定c-Jun是负责HCC细胞中Gln剥夺后TRIB3诱导的主要转录激活因子。
2.4 TRIB3通过维持DDR通路激活来支持高效DDR
基于观察到HCC细胞在Gln剥夺下的持续氧化应激中解决了DNA损伤，并已确定TRIB3为应激诱导的核调节因子，我们接下来询问TRIB3是否协调DDR。TRIB3耗竭的HepG2细胞的RNA-seq分析揭示了HR、错配修复(MMR)和切除修复通路的广泛下调，提示TRIB3有助于DDR程序的激活。与持续的DNA损伤一致，TRIB3耗竭增加了基础条件下γ-H2A.X灶的积累和DNA损伤。此外，TRIB3敲低加剧了Gln饥饿下的γ-H2A.X水平，而TRIB3过表达则阻止了与Gln耗竭相关的γ-H2A.X增加，表明TRIB3促进DSBs的解决。为了评估这一点，我们用DNA损伤剂依托泊苷(VP-16)处理细胞以快速诱导DSBs。我们观察到γ-H2A.X水平在TRIB3敲低细胞中在治疗6小时后持续存在，而TRIB3过表达与对照细胞相比促进了γ-H2A.X水平的相对下降。这些发现进一步将TRIB3与直接基因毒性挑战后DSB相关DDR的持续调节联系起来。
总的来说，这些结果表明TRIB3在代谢和基因毒性应激环境中通过支持DDR过程来促进HCC的基因组完整性。
2.5 TRIB3与DDX5形成核复合体以调节DDR
为了揭示TRIB3基因组维持功能背后的分子伙伴，我们在HepG2细胞中针对异位表达的FLAG-TRIB3进行了亲和纯化质谱(AP-MS)。在消除假象后，该分析鉴定出202个候选蛋白，包括TRIB3的稳健回收和先前报道的相互作用蛋白COP1。使用STRING数据库构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，我们恢复了一个与泛素依赖性蛋白质降解相关的细胞组分的紧凑模块，包括蛋白酶体亚基α(PMSA)蛋白。TRIB3形成了与解旋酶DDX5和RNA结合蛋白HNRNPH2紧密相连的外围节点的一部分，而COP1相互作用形成了与蛋白酶体模块的中间连接。一致地，对PPI网络蛋白的基因本体论(GO)富集分析恢复了强的蛋白酶体相关特征，以及与端粒维持和蛋白质折叠相关功能的匹配。
与COP1一起，我们试图验证TRIB3、DDX5和HNRNPH2之间的候选结合相互作用，包括在分析中特别与TRIB3共纯化、但置信度较低的TCP1。靶向FLAG-TRIB3的免疫沉淀(IP)实验显示COP1被稳健回收，TRIB3被选择性回收，HNRNPH2回收较少，但TCP1无结合。在内源性背景下进行的实验表明，TRIB3和DDX5在共IP实验中被相互回收。此外，邻近连接分析(PLA)检测到TRIB3和DDX5之间的相互作用，主要位于细胞核中。结构域图谱分析显示DDX5结合到TRIB3的伪激酶结构域(aa 118-314)，而TRIB3与DDX5的C端转录激活结构域(aa 476-614)结合。为了进一步建立直接结合，我们使用纯化的重组TRIB3-His和DDX5-FLAG蛋白进行了体外共IP，这证实了在无细胞共因子的限定系统中的特异性相互相互作用。总之，这些数据证明TRIB3通过其伪激酶结构域与DDX5的C端转录激活结构域之间的直接、相互相互作用，与DDX5形成特异的核复合体。
如果TRIB3-DDX5相互作用在功能上有助于TRIB3介导的DNA损伤反应，我们推测DDX5的敲低应该重现TRIB3沉默的效应。相应地，使用独立的shRNA靶向敲低DDX5导致γ-H2A.X水平、核灶形成和DNA断裂的显著增加。这种对TRIB3耗竭时观察到的DDR的表型模拟强烈表明DDX5不仅仅是相互作用伙伴，而且是该复合体的重要功能组分。然而，DDX5如何促进TRIB3介导的DDR仍然是一个悬而未决的问题。
2.6 TRIB3促进DDX5与基因组G4-DNA的结合
鉴于DDX5是已知的G4结构解旋酶，且未解决的G4s是复制应激和基因组不稳定的已知驱动因素，我们假设TRIB3-DDX5复合体可能通过主动解旋G4-DNA结构来抑制DNA损伤。为了验证这一点，我们首先使用BG4单克隆抗体评估了全局G4动态，这是一种与落射荧光显微镜结合时检测原位G4结构的经过充分验证的工具。与我们的假设一致，敲低TRIB3显著增加了核G4结构，这种效应在Gln剥夺下被放大。值得注意的是，DDX5敲低产生了与TRIB3敲低相同的表型结果，表明这两种蛋白在同一通路中发挥作用以解旋G4结构。为了补充这些观察结果，我们进行了BG4的CUT&Tag分析，以在基因组分辨率下检查G4-DNA占据。集中于转录起始位点(TSS)区域的分析表明，TRIB3敲低在基础培养条件下适度增加了G4-DNA信号强度，这种效应在Gln限制下进一步增强。这些结果证实了免疫荧光数据，并支持TRIB3缺失与启动子近端区域G4-DNA积累之间的关联。
接下来，为了确定TRIB3和/或DDX5是否直接与G4结构相互作用，我们设计了生物素化的Myc-G4探针——一种广泛使用的基准G-四链体结构——以及Myc突变对照探针，用于体外下拉实验。我们发现HepG2细胞中的内源性TRIB3和DDX5被Myc-G4而非对照探针有效回收。此外，TRIB3过表达增强了DDX5在Myc-G4实验中的回收，尽管这不是由TRIB3改变DDX5水平引起的，正如TRIB3敲低和过表达实验所示，这表明TRIB3促进了DDX5对G4结构的募集。实际上，用重组蛋白进行的体外结合实验表明，TRIB3被Myc-G4探针稳健回收，建立了TRIB3与G4-DNA之间直接的、结构依赖的相互作用。
为了在完整细胞中证明这一功能，我们利用PLA与BG4探针来评估G4 DNA结构与TRIB3或DDX5之间的结合。在细胞核内，我们容易观察到代表G4 DNA、TRIB3和DDX5之间相互作用的PLA灶，而TRIB3敲低显著减少了BG4和DDX5之间的相互作用灶。作为这些相互作用G4依赖性的进一步验证，我们将G4诱饵(凝血酶结合适配体，TBA)转染到HepG2细胞中，然后重复基于PLA的实验。虽然TBA转染显著降低了BG4-DDX5 PLA信号，但不影响TRIB3-DDX5蛋白质相互作用，证明内源性TRIB3-DDX5复合体可以在不解离核心蛋白质相互作用的情况下被竞争性置换。
总的来说，这些发现支持了一个模型，其中TRIB3作为G4结合支架发挥作用，促进DDX5与基因组G4结构的结合。在TRIB3或DDX5缺失后观察到的G4-DNA积累，以及这种表型在Gln限制条件下的增强，与它们在限制G4持续存在的通路中的协同参与是一致的。TRIB3耗竭与启动子近端区域G4占据改变相关的进一步观察促使我们接下来在TRIB3/DDX5缺陷细胞中检查受损G4调节的转录后果。
2.7 TRIB3-DDX5阻止G4驱动的HR基因转录抑制
在确立了TRIB3-DDX5复合体与G4结构相互作用并与它们的解旋相关之后，我们接下来检查了TRIB3或DDX5耗竭细胞中的G4积累是否与DNA修复通路的转录变化相关，正如我们的RNA-seq数据所暗示的那样。我们聚焦于HR，因为它依赖于关键基因如BRCA1和RAD51AP1的持续表达。与此一致，在标准培养条件下，敲低TRIB3和DDX5都伴随着多个HR组分(BRCA1、RAD51AP1、PARP1和RAD51)在mRNA和蛋白质水平上的表达降低。TRIB3耗竭对HR基因表达的抑制作用也在Gln剥夺下观察到，表明这种关联不限于Gln限制条件。值得注意的是，DDX5过表达导致TRIB3敲低细胞中HR介体蛋白水平的有限恢复，表明TRIB3有助于维持这些因子的基础表达。与此一致，异位DDX5表达减弱了TRIB3耗竭后观察到的DNA断裂和γ-H2A.X灶的增加，尽管未能完全恢复正常，表明功能挽救不完全。
为了进一步探索G4结构与HR基因表达之间的联系，我们用小分子G4稳定剂处理细胞。吡啶他汀处理重现了TRIB3或DDX5敲低的几个特征，包括HR基因表达的剂量依赖性减少和γ-H2A.X积累增加。重要的是，PhenDC3——一种结构不同的、据报道具有较少脱靶效应的G4配体——同样降低了HR/DDR基因的表达，支持了G4稳定与修复基因转录减少之间的关联。
总的来说，这些发现支持了一个模型，其中TRIB3-DDX5复合体与DDR基因表达的维持相关，可能通过对G4相关DNA结构的调节。
2.8 TRIB3-DDX5与启动子G4结构和HR基因表达相关
基于将TRIB3-DDX5与HR基因表达和G4相关表型联系起来的证据，我们接下来询问这种调节关系是否涉及它们与HR基因启动子中G4结构的结合。为了识别BRCA1和RAD51AP1启动子中的G4基序，我们首先从G4Bank数据库中检索了实验定义的G4序列，然后使用QGRS映射器算法识别最高得分的基序。在这些基因及其直接邻居的紧密头对头方向内，我们在BRCA1的第一个外显子、与NBR1重叠的上游基序以及位于RAD51AP1和FERRY3之间的两个额外基序中识别了高得分的G4共有基序。在这些区域映射占据的CUT&Tag分析实验显示，每个靶标在Gln剥夺条件下具有良好的重复一致性，并在包含预测G4基序的BRCA1和RAD51AP1启动子区域内检测到BG4、TRIB3和DDX5的重叠峰。G4启动子结构内的共同占据模式提出了TRIB3-DDX5复合体直接与启动子G4基序结合的可能性。此外，在这些位点观察到的TRIB3敲低后升高的G4信号，进一步推进了TRIB3可能具有解旋G4结构功能的观点。
为了建立TRIB3-DDX5对G4-DNA的募集的分子基础，我们对Myc-G4阳性对照进行了比较性下拉实验，评估它们回收TRIB3和DDX5的相对效率。令人惊讶的是，只有BRCA1-G4-1探针提供了与MYC-G4相当的靶标富集，尽管其他探针也在不同程度上选择性结合TRIB3和DDX5，可能反映了不同G4位点的结合亲和力差异。用基于MYC-G4、BRCA1-G4-1、RAD51AP1-G4-1序列的茎环和双链DNA(dsDNA)对照探针重复这些实验，证实观察到的相互作用是G4形成序列特异性的。
为了更好地理解探针依赖性差异，我们使用圆二色性(CD)光谱表征了每个G4探针的折叠拓扑结构和热稳定性，检查了它们的CD特征和温度依赖性解链曲线。与既定标准一致，MYC-G4和RAD51AP1-G4-2探针主要采用平行G4构象，BRCA1-G4-2显示出反平行样特征，而BRCA1-G4-1和RAD51AP1-G4-1表现出混合型特征。CD熔解曲线揭示了这些基序之间不同的热稳定性，支持了G4拓扑结构和稳定性的差异有助于在下拉实验中观察到的TRIB3/DDX5差异富集的观点。
在确立了TRIB3募集DDX5到G4-DNA后，我们接下来询问这种募集是否增强了DDX5的G4解旋酶活性。为了评估这一点，我们通过将荧光标记的MYC-G4探针与纯化的TRIB3和DDX5蛋
