基于哌嗪功能化二氧化硅纳米颗粒的胰岛素口服递送系统：在肥胖小鼠模型中的突破性研究

《Advanced Science》：Piperazine-Functionalized Nanoparticles Enable Oral Insulin Delivery in Obese Mice

本研究针对糖尿病治疗中胰岛素等大分子药物口服生物利用度低的挑战，创新性地开发了1-苯基哌嗪（PPZ）功能化的大孔二氧化硅纳米颗粒（LPSNP-PPZ）。该新型递送系统在小鼠模型中被证明能够作为一种安全、高效、无毒性的肠道渗透促进剂（PE），可逆地调节紧密连接，显著增强大分子（如胰岛素）的肠道吸收，实现持续平稳的血糖控制，为口服大分子药物的临床转化提供了极具潜力的解决方案。

文章内容总结

1 引言

糖尿病已成为全球范围内流行的主要致死性疾病之一。胰岛素是治疗1型糖尿病和约25%的2型糖尿病的关键药物，但当前主要依赖注射给药。对针头的恐惧和注射疼痛导致约30%的糖尿病患者感到焦虑，近50%的患者曾故意漏用剂量，严重影响治疗依从性和疾病预后。因此，口服胰岛素递送具有巨大的临床获益潜力，可显著改善患者体验和治疗效果。然而，胰岛素等大分子药物存在肠道上皮和黏液屏障通透性差、口服生物利用度低等挑战。尽管已有纳米颗粒、离子液体、化学渗透促进剂（PEs）等多种策略，但尚无口服胰岛素产品成功上市。化学PEs如脂肪酸、脂质和1-苯基哌嗪（PPZ）虽然有效，但在有效剂量下具有毒性。近期研究发现，二氧化硅纳米颗粒可增强胰岛素和艾塞那肽等药物的肠道渗透性和口服递送，但其效果仍不及上述化学PEs。本研究提出将PPZ嫁接到二氧化硅纳米颗粒上，旨在结合PPZ的强渗透促进能力与二氧化硅纳米颗粒的载体优势，在提高效率的同时降低毒性。

2 结果与讨论

2.1 1-苯基-4-[3-（三甲氧基硅基）丙基]哌嗪的合成

成功合成了用于大孔二氧化硅纳米颗粒（LPSNP）硅烷化的1-苯基-4-[3-（三甲氧基硅基）丙基]哌嗪（“PPZ硅烷”）。通过¹³C NMR和¹H NMR谱图分析确认了产物的结构和纯度，为后续功能化提供了关键中间体。

2.2 1-苯基哌嗪功能化LPSNP的合成与表征

以十六烷基三甲基氯化铵（CTAC）为模板，三乙醇胺（TEA）为催化剂，正硅酸四乙酯（TEOS）为硅源，合成了LPSNP。随后通过硅烷化反应将PPZ接枝到LPSNP表面，制得功能化纳米颗粒LPSNP-PPZ。通过固态¹³C NMR证实PPZ硅烷在接枝后保持了预期结构。傅里叶变换红外光谱（FTIR）在1600 cm^-1处（C=C伸缩振动）和~3000 cm^-1处（C-H键）的新峰，进一步证明了PPZ基团的存在。扫描电子显微镜（SEM）、暗场扫描透射电子显微镜（STEM）和元素分析（EDS）显示，LPSNP和LPSNP-PPZ均具有大孔和枝状结构，且在LPSNP-PPZ中检测到氮信号，证实了哌嗪环的存在。通过控制PPZ硅烷的用量，制备了具有高（LPSNP-PPZ_H）、中（LPSNP-PPZ_M）、低（LPSNP-PPZ_L）不同接枝密度的纳米颗粒。高密度接枝导致颗粒疏水性显著增加（接触角>90°），而低密度接枝或原始LPSNP则具有良好的润湿性（接触角<90°）。透射电镜（TEM）显示所有颗粒尺寸均约90 nm，呈枝状结构，功能化未显著改变颗粒尺寸和结构。氮气吸附-脱附等温线表明所有颗粒均具有典型的IV型等温线，为介孔结构。随着PPZ接枝密度增加，颗粒的比表面积（BET）、孔径和孔容均相应减小。Zeta电位测定显示，原始LPSNP因硅醇基团带负电（约-20 mV），而PPZ功能化后颗粒因哌嗪基团带正电（约+25至+30 mV）。动态光散射（DLS）测得的流体力学直径在150-200 nm之间，高于TEM测得的尺寸。热重分析（TGA）进一步量化了不同颗粒的有机含量和接枝密度。

2.3 颗粒与黏蛋白的相互作用

通过DLS评估了颗粒在黏蛋白溶液中的相互作用，以模拟肠道黏液屏障。原始LPSNP在黏蛋白中孵育180分钟后，粒径从约90 nm增加到255 nm，表明与黏蛋白发生了相互作用和聚集。而不同接枝密度的PPZ功能化颗粒（LPSNP-PPZ_H/M/L）在180分钟内粒径均维持在约100 nm左右，未发生显著增加。这提示PPZ功能化可能减少颗粒与黏液的相互作用，有利于其穿过黏液层到达上皮细胞。

2.4 体外细胞毒性

通过MTS法评估了LPSNP、不同PPZ功能化LPSNP以及游离PPZ对Caco-2细胞和HT29-MTX细胞的毒性。结果表明，在0.1-2 mg/mL浓度下，LPSNP和PPZ功能化LPSNP对两种细胞系均无显著细胞毒性。然而，游离的PPZ溶液在5 mM（0.081 mg/mL）浓度下即导致Caco-2细胞活力降低50%，HT29-MTX细胞活力降低75%，表现出显著毒性。在长达7天的持续培养实验中，纳米颗粒也未表现出明显的长期细胞毒性。进一步的共聚焦显微镜观察（鬼笔环肽染色肌动蛋白）证实，PPZ在高浓度下会显著减少细胞数量和破坏肌动蛋白骨架，而原始LPSNP和PPZ功能化LPSNP（2 mg/mL）对细胞形态和数量无不良影响。这些结果支持LPSNP-PPZ可作为安全的渗透促进剂。

2.5 LPSNP-PPZ颗粒对体外单层细胞模型的影响

Caco-2单层模型：在Caco-2细胞单层（Transwell模型）上评估了颗粒对跨上皮电阻（TEER）和胰岛素渗透性的影响。与LPSNP和LPSNP-PPZ_L类似，LPSNP-PPZ_H和LPSNP-PPZ_M也能引起TEER的可逆性下降，且在3小时后恢复，表明其作用是短暂且可逆的。胰岛素渗透性实验显示，在3小时时，LPSNP-PPZ_H处理组表现出最高的胰岛素渗透性，其表观渗透系数（P_app）为4.5 × 10^-5cm/s，显著高于原始LPSNP（2.6 × 10^-5cm/s）。

Caco-2/HT29-MTX共培养模型：为模拟更真实的具有黏液层的肠道屏障，使用了Caco-2与黏液分泌细胞HT29-MTX的共培养模型。在此模型中，PPZ功能化的LPSNP同样表现出显著降低TEER值的能力，并促进了更高的胰岛素渗透性和P_app值。在两种体外模型中，LPSNP-PPZ_L在降低TEER方面略强，而LPSNP-PPZ_H在促进胰岛素渗透方面更优，这可能与不同接枝密度导致的疏水性和细胞相互作用差异有关。免疫荧光染色显示，LPSNP-PPZ处理导致紧密连接蛋白ZO-1分布变得不连续，从机制上解释了其对上皮屏障的可逆调节作用。

2.6 LPSNP-PPZ纳米颗粒促进大分子在小鼠体内的口服吸收

FITC-葡聚糖4 kDa（FITC-DX4）吸收实验：首先以与胰岛素分子量相近的FITC-DX4为模型大分子，在健康小鼠中评估了颗粒的体内渗透增强效果。口服给予不同纳米颗粒（100 mg/kg）2小时后，再口服FITC-DX4。结果显示，与LPSNP和PBS对照组相比，LPSNP-PPZ_H和LPSNP-PPZ_L均能显著提高血清中FITC-DX4的吸收水平。组织学（H&E染色）分析显示，单次给药后，在结肠、小肠、肝脏、肾脏和肺中均未观察到急性毒性迹象。

口服胰岛素递送治疗高脂饮食（HFD）小鼠：在通过12周高脂饮食诱导出胰岛素抵抗和高血糖的HFD小鼠模型中，评估了LPSNP-PPZ对口服胰岛素的递送效果。为保护胰岛素免受胃酸破坏，将胰岛素与蛋白酶抑制剂封装于小鼠用M号胶囊中，并用Eudragit L100-55进行肠溶包衣。小鼠禁食10小时后，先口服纳米颗粒（100 mg/kg），2小时后（此时纳米颗粒诱导的肠道渗透性最高）再口服胰岛素胶囊（675 U/kg）。血糖监测显示，与仅口服胰岛素的对照组相比，LPSNP-PPZ_H和LPSNP-PPZ_L处理组能够更显著、更持久地降低血糖水平，效果可持续8-10小时。注射胰岛素组血糖迅速下降，4小时后恢复正常。在给药后4、6、8小时，LPSNP-PPZ联合口服胰岛素组的血糖降低效果显著优于单独口服胰岛素组，甚至在某些时间点与注射胰岛素组无显著差异或效果更持久。重要的是，对胰腺、结肠各段、小肠、肝脏和肾脏的H&E染色分析再次证实，所有治疗均未引起急性系统性毒性或明显的免疫细胞浸润。

3 结论

本研究探索了1-苯基哌嗪（PPZ）功能化的大孔二氧化硅纳米颗粒（LPSNP-PPZ）作为一种新型口服大分子药物递送渗透促进剂的潜力。通过可重复、高纯度的合成路线成功制备了LPSNP-PPZ。体外实验表明，LPSNP-PPZ可逆地调节Caco-2和Caco-2/HT29-MTX细胞单层的紧密连接，暂时降低跨上皮电阻，从而增强大分子（如胰岛素）的旁细胞转运。体内实验进一步证实，与原始LPSNP相比，LPSNP-PPZ能显著促进健康小鼠对FITC-葡聚糖（4 kDa）的肠道吸收。更重要的是，在模拟糖尿病前期的高脂饮食肥胖小鼠模型中，LPSNP-PPZ有效增强了口服胰岛素的吸收，实现了显著且持久的血糖控制，且未观察到急性毒性。这项工作首次证明，PPZ接枝的二氧化硅纳米颗粒可以作为一种安全、高效的渗透促进剂，用于胰岛素及其他潜在生物大分子药物的口服给药，为克服传统化学渗透促进剂的毒性难题和推动口服大分子疗法的发展提供了创新性策略。尽管研究聚焦于肠道屏障，但其发现也可能为跨越血脑屏障、肺上皮屏障等其他生物屏障的药物递送提供启示。