《Advanced Science》：A Photothermal Transducer Regulates Transmembrane Calcium Flow for Synergistic Osteoarthritis Therapy
编辑推荐：
本文报道了一种新型光热纳米传感器M2M@BPSC，通过近红外（NIR）响应产生温和热疗，选择性抑制巨噬细胞上的瞬时受体电位香草素亚型4（TRPV4）通道，减少钙离子内流，进而通过STAT6-EGR2信号轴促进巨噬细胞向抗炎M2表型极化。M2巨噬细胞通过旁分泌作用双向调节软骨细胞和成纤维样滑膜细胞（FLS），恢复软骨细胞外基质（C-ECM）合成与纤维化ECM（F-ECM）沉积的平衡，从而协同逆转骨关节炎（OA）的病理微环境，为OA治疗提供了创新的光热-免疫联合治疗策略。
1. 引言
骨关节炎（OA）是一种普遍存在的退行性关节疾病，传统上认为主要由软骨退变驱动。然而，非软骨细胞，特别是滑膜巨噬细胞，在疾病发展中起着关键作用。巨噬细胞功能障碍会通过分泌特定蛋白间接损害软骨细胞功能，破坏C-ECM完整性，并形成一个持续的“炎症-降解”恶性循环，加速OA进展。因此，恢复受损的巨噬细胞功能为OA治疗提供了新的策略。与传统疗法相比，温和温度光热疗法（PTT）具有非侵入性和高选择性的优势。黑磷纳米片（BPNS）作为一种具有高光热转换效率的二维纳米材料，是理想的光热剂。然而，天然BPNS的抗氧化能力有限，且缺乏靶向性。硒掺杂碳量子点（SeCQDs）具有良好的生物相容性和增强内源性抗氧化防御的能力。本研究设计了一种新型多功能光热传感器M2M@BPSC，它将BPNS的光热性能、SeCQDs的抗氧化能力以及白细胞介素-4（IL-4）诱导的M2巨噬细胞膜（M2M）的靶向引导相结合，旨在通过精准调控巨噬细胞功能来缓解OA进展。
2. 结果与讨论
2.1 BPSC的制备与表征
通过液相剥离法制备了二维BPNS，并采用原位生长法合成了附着有SeCQDs的BPSC复合材料。透射电子显微镜（TEM）和扫描电子显微镜（SEM）图像证实了BPNS和BPSC的超薄纳米片结构，SeCQDs沉积在BPNS表面。原子力显微镜（AFM）测量显示BPNS和BPSC的厚度约为3纳米。元素分析证实了BPSC中磷（P）、氧（O）和硒（Se）的存在。紫外-可见吸收光谱显示BPSC在约260纳米处出现了SeCQDs的特征吸收峰。光热性能测试表明，BPSC的温度随其浓度或近红外（NIR，808纳米）照射强度的增加而逐渐升高，且具有良好的光热稳定性。综合考虑光热转换效率和避免副作用，后续实验选择了最佳处理方案（100微克/毫升，1.25瓦/平方厘米），以产生适度的光热效应（约42°C）。
2.2 BPSC+NIR诱导巨噬细胞重编程并改善线粒体功能
体外生物安全性评估显示BPSC对骨髓源性巨噬细胞（BMDM）无细胞毒性。在脂多糖（LPS）诱导的M1极化模型中，BPSC处理降低了巨噬细胞中促炎标志物CD86的表达，并提高了抗炎标志物CD206的表达。在NIR照射下，BPNS和BPSC组的这种有益效果显著增强。流式细胞术进一步证实，BPSC尤其在NIR干预下，促进了巨噬细胞从M1向M2表型的重编程。此外，BPSC+NIR处理恢复了线粒体膜电位（MMP），有效清除了细胞外和线粒体内的活性氧（ROS），并增强了巨噬细胞的线粒体有氧呼吸能力和ATP产量，同时上调了线粒体呼吸链复合物亚基（ATP5A， SDHA， MT-ND4）的表达。这些结果表明，BPSC结合NIR通过恢复巨噬细胞线粒体功能，促进抗炎M2极化。
2.3 BPSC诱导的PTT抑制TRPV4离子通道活性以限制钙离子过度内流
瞬时受体电位香草素通道4（TRPV4）是一种热敏离子通道。实验发现，随着BPSC+NIR处理时间的延长，巨噬细胞中TRPV4的表达逐渐下降。膜片钳实验表明，BPSC+NIR处理降低了TRPV4通道活性。在同一个细胞内进行的连续全细胞电压钳记录显示，TRPV4电流对光热刺激呈现多相反应：30秒时增强，30至60秒时下降，90秒时显著抑制，表明其逐渐脱敏。与TRPV4活性的多相变化相对应，其下游的磷酸化钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II（P-CaMKII）表达水平也呈现先升后降的趋势。使用特异性激动剂GSK1016790A激活TRPV4，会上调TRPV4和P-CaMKII的表达，并促进钙离子内流，最终导致胞质钙超载。而BPSC+NIR处理则降低了细胞内和线粒体内的钙离子浓度。钙超载会导致MMP丧失、氧化损伤增加和线粒体功能障碍。实验证实，GSK1016790A处理逆转了BPSC+NIR对巨噬细胞有氧呼吸、能量代谢、呼吸链复合物表达、内源性抗氧化能力以及抗炎M2表型的促进作用。此外，用siRNA敲低TRPV4与BPSC+NIR处理产生了相似的有益效果。这表明BPSC诱导的光热效应通过抑制TRPV4离子通道活性，限制钙离子内流，从而起到线粒体保护作用。
2.4 BPSC诱导的PTT通过STAT6-EGR2信号通路促进抗炎极化
对经BPSC+NIR处理的M1巨噬细胞进行RNA测序分析。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，BPSC处理上调了JAK-STAT和FoxO信号通路。基因集富集分析（GSEA）进一步证实BPSC处理增强了巨噬细胞中JAK-STAT信号通路的活性。在差异表达的转录因子中，早期生长反应蛋白2（EGR2）被确定为响应BPSC+NIR和TRPV4激活的关键转录因子。通过生物信息学分析和染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据验证，发现信号转导和转录激活因子6（STAT6）是EGR2的潜在上游调节因子。核质分离实验显示，BPSC处理促进了STAT6的核转位，而TRPV4的再激活则消除了这一效应。相应地，BPSC处理或敲低TRPV4增强了STAT6的磷酸化。免疫荧光染色进一步证实了STAT6和EGR2的这种动态分布。利用JASPAR数据库预测，在EGR2启动子区域发现了三个候选STAT6结合位点。染色质免疫沉淀-聚合酶链式反应（ChIP-PCR）结果证实，位点1（TTCCTAGGAT）是STAT6在EGR2启动子上的主要结合位点。重新分析已发表的ChIP-seq数据集也验证了STAT6在EGR2启动子区域的结合。最后，用siRNA沉默STAT6表达，部分逆转了BPSC处理对巨噬细胞表型转换的保护作用，并导致EGR2向细胞核的转位减少。这些结果表明，BPSC诱导的PTT通过激活STAT6-EGR2信号轴促进巨噬细胞M2极化。
2.5 BPSC诱导的PTT间接防止C-ECM降解和成纤维细胞增生
巨噬细胞可以通过旁分泌信号与靶细胞通信。实验使用不同极化状态的巨噬细胞条件培养基处理小鼠关节软骨细胞。结果表明，BPSC介导的PTT促进了C-ECM的生成（如II型胶原蛋白表达增加），并降低了基质金属蛋白酶13（MMP13）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达。然而，TRPV4通道的再激活减弱了这些有益效果。另一方面，使用相同条件培养基处理小鼠成纤维样滑膜细胞（CP-M323）。二维划痕实验、三维Transwell迁移实验以及基质胶侵袭实验均表明，BPSC+NIR显著抑制了FLS的迁移和侵袭能力，而GSK1016790A则逆转了这种抑制。定量分析显示，BPSC+NIR通过光热信号-TRPV4-钙离子通路，抑制了纤维化ECM（F-ECM）标志物（如I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、α-平滑肌肌动蛋白）的表达。因此，BPSC+NIR通过调节巨噬细胞表型，以旁分泌方式间接保护了C-ECM和F-ECM的稳态。
2.6 M2M@BPSC+NIR改善创伤后骨关节炎小鼠模型的病理表型和运动功能
为提高体内靶向性，使用IL-4诱导的M2巨噬细胞膜包裹BPSC，合成了M2M@BPSC。透射电镜和原子力显微镜证实了膜涂层的存在。得益于同型靶向能力，M2M@BPSC在F4/80标记的滑膜巨噬细胞中积累更多。体内光热实验显示，局部NIR照射后膝关节温度可超过42°C。通过手术诱导内侧半月板不稳定建立经典的创伤后OA（PTOA）模型。治疗结果表明，M2M@BPSC凭借其固有的抗炎特性，在减少M1阳性巨噬细胞数量和增加M2阳性巨噬细胞数量方面表现出更优的效果。苏木精-伊红（H&E）染色显示，BPSC或M2M@BPSC治疗，特别是在NIR激光照射下，减轻了滑膜的纤维化和增生。番红O（S.O.）染色和OARSI评分表明，M2M@BPSC+NIR有效防止了关节软骨降解，增加了透明软骨厚度。步态分析和旷场实验显示，M2M@BPSC+NIR治疗显著改善了肢体活动能力和运动功能。重要器官的组织学检查和血清生化分析未发现明显的肝毒性或肾毒性。
2.7 M2M@BPSC+NIR以TRPV4依赖性方式恢复软骨和滑膜稳态
通过使用TRPV4激动剂GSK1016790A，在体内验证了TRPV4在M2M@BPSC+NIR治疗中的作用。免疫荧光分析显示，M2M@BPSC+NIR处理抑制了滑膜组织中TRPV4的表达，而GSK1016790A逆转了这种抑制。此外，TRPV4的激活减弱了治疗对滑膜炎症的改善作用，表现为持续的FLS增生和滑膜内巨噬细胞极化失调。在软骨保护方面，TRPV4激活导致透明软骨厚度减少，并促进软骨磨损和降解。同时，TRPV4激动剂加剧了软骨下骨硬化和骨赘形成。功能测定表明，M2M@BPSC+NIR通过抑制TRPV4信号通路促进了下肢活动能力的恢复，而GSK1016790A则减弱了这种效果。
3. 结论
综上所述，本研究开发了一种新型光热转换器M2M@BPSC，能够对滑膜巨噬细胞进行精准温和加热。局部温升触发TRPV4离子通道关闭，限制钙离子内流，防止线粒体钙超载。同时，TRPV4抑制激活了STAT6-EGR2轴，促进巨噬细胞向抗炎表型极化。最终，M2M@BPSC治疗恢复了F-ECM和C-ECM之间的平衡，抑制了滑膜炎症并减轻了软骨退变。这些发现凸显了M2M@BPSC作为OA光热-免疫联合治疗的一种有前景的新策略。
