《Advanced Science》：Bifunctional Artificial Enzymes-Loaded Microgels With LOX- and CAT-Like Activities for Metabolic Reprogramming and Scarless Wound Repair
编辑推荐：
本文开发了一种具有乳酸氧化酶（LOX）和过氧化氢酶（CAT）活性的双功能人工酶Metazyme，并将其封装于棒状微凝胶中构建MetaRgel平台。该平台能够通过级联催化反应有效清除伤口微环境中过量的乳酸和活性氧（ROS），缓解缺氧，抑制糖酵解相关蛋白（如PKM2、PDK1）及促炎/促纤维化因子（如IL-6、TGF-β1）的表达，从而重塑代谢-炎症-纤维化轴，在大鼠全层皮肤缺损模型中显著加速了伤口愈合并减少了纤维化瘢痕的形成，为代谢调控和疤痕修复提供了创新策略。
负载双功能人工酶的微凝胶用于代谢重编程与无痕伤口修复
1 引言
皮肤损伤后异常的伤口愈合常导致持续性炎症和纤维化瘢痕形成，其根本原因在于局部微环境的代谢重编程和免疫失调激活。受伤组织通常会经历缺氧，从而触发糖酵解激活（Warburg效应）并导致乳酸过度积累。临床研究报道，伤口渗出液中乳酸浓度中位数可达21.03 mM，显著高于正常组织。乳酸不仅是糖酵解的副产物，更是一种复杂的信号分子，主动调节伤口愈合。早期的乳酸瞬时升高可支持血管生成、巨噬细胞募集和上皮再生。相反，在持续缺氧和未解决的炎症下，过度的乳酸积累会驱动病理性信号级联，包括稳定缺氧诱导因子-1α（HIF-1α），从而建立代谢-炎症反馈环路。乳酸还会促进活性氧（ROS）产生，诱导成纤维细胞代谢重编程为糖酵解依赖表型，并增强胶原和细胞外基质（ECM）合成，加速瘢痕形成。此外，乳酸可作为组蛋白赖氨酸乳酰化的供体，直接激活如I型胶原α1链（COL1A1）等促纤维化基因的转录，进一步放大ECM沉积。因此，失调且持续的乳酸积累不仅是代谢失调和炎症放大的标志，也是成纤维细胞重编程和ECM过度产生的关键介质。靶向乳酸代谢及其下游通路，有望成为调节糖酵解和逆转纤维化瘢痕的治疗策略。
目前针对乳酸的抗纤维化干预主要集中在减少乳酸产生或阻断其转运的糖酵解抑制剂和单羧酸转运蛋白（MCT）阻滞剂。然而，这些全身性药剂存在组织特异性差、潜在代谢毒性和在缺氧微环境中疗效有限等问题，凸显了对局部、可持续的乳酸调节方法的需求。
为了调节代谢和炎症微环境，基于乳酸氧化酶（LOX）和过氧化氢酶（CAT）构建级联催化系统已成为一种有前景的代谢干预策略。天然LOX催化乳酸氧化为丙酮酸，产生过氧化氢（H2O2）。但其活性依赖氧气，且在酸性和缺氧条件下易降低，限制了其在缺氧或纤维化微环境中的有效性。与乳酸相比，丙酮酸已被证明主要驱动成纤维细胞转向氧化磷酸化（OXPHOS）主导的代谢状态。缺氧或纤维化环境还具有高水平的ROS，尤其是H2O2，这会加剧氧化应激。CAT样酶可以帮助分解H2O2生成水和氧气，在减少ROS损伤的同时为LOX功能提供氧气支持。由于乳酸的清除依赖氧气，将LOX样和CAT样活性结合在单一系统中至关重要。这种双功能人工酶能够实现连续的乳酸氧化、ROS清除和局部氧生成，形成一个自我维持的催化循环，应对高乳酸、缺氧和氧化应激。为克服这些限制，人工酶作为具有可调结构、强健稳定性和多功能性的酶模拟催化剂被开发出来。同时，在伤口环境中，人工酶在伤口微环境内的有效定位和滞留对于实现持续治疗效果至关重要。在本设计中，微凝胶支架作为结构和功能基质，将Metazyme保留在伤口部位，实现对局部微环境的持续催化调节。前期工作表明，与本体水凝胶相比，棒状微凝胶具有相互连通的孔结构，有利于气体交换和渗出物吸收，使其特别适用于动态的伤口环境。
本研究的核心发现是开发了一种具有LOX样和CAT样活性的级联Co/Mn基人工酶，并将其嵌入棒状微凝胶支架中，实现了对伤口微环境的局部、持续催化调节。该平台能够协同调节乳酸和ROS水平，从而调节糖酵解活性、细胞因子表达和成纤维细胞活化，最终在抑制纤维化瘢痕的同时促进伤口愈合。通过同时解决代谢重编程和氧化应激，这种基于材料的方法能够调节代谢-免疫-纤维化轴并打破其正反馈循环，为无痕伤口愈合提供了一种有前景的策略。
2 结果与讨论
2.1 MnPBA和Metazyme的结构表征
普鲁士蓝类似物（PBAs）因其易于合成、结构可调和固有催化活性而在组织再生领域受到关注。在氨（NH3）气氛下进行热处理可以重组原子排列，从而赋予新的催化特性。本研究将锰基PBA（MnPBA）在NH3中于550°C热解3小时，得到了一种具有LOX和CAT样活性的新型人工酶，称为Metazyme。
扫描电子显微镜（SEM）显示，热解后形态从MnPBA中明确的立方体颗粒转变为具有可见凹痕和通道状结构的粗糙表面。透射电子显微镜（TEM）进一步显示NH3蚀刻诱导了中空内部以及表面的介孔和微孔。高分辨率TEM图像显示出平行的晶格条纹，表明存在部分石墨化。像差校正扫描透射电子显微镜（AC-STEM）揭示了Metazyme中金属的异质分布，存在原子分散的物种和小簇。X射线衍射（XRD）证实了从MnPBA前体到最终Metazyme的结构演变，热解后衍射峰显著弱化和宽化，表明向部分非晶或纳米晶结构转变。X射线光电子能谱（XPS）用于探测MnPBA和Metazyme的元素组成和化学状态。在Metazyme的高分辨率C 1s谱中，284.8、286.3、288.7和292.6 eV处的峰分别对应于C-金属、C-C、C-N和C=O键。N 1s谱显示在397.6 eV处有一个峰归属于Co4N相中的N-Co，以及在398.2和399.4 eV处归属于氨热处理过程中形成的吡咯氮（N-H）末端基团。O 1s谱中，529.2和530.7 eV处的峰表明存在O-金属键和吸附的羟基或氧物种。Mn 2p谱在642 eV（Mn 2p3/2）和654 eV（Mn 2p1/2）处显示两个主峰，这是MnO中Mn2+的特征。Co 2p谱在780.8和796.0 eV处显示峰，对应于Co4N/C结构中的Co-N键，表明氮成功掺入钴晶格。
为了研究金属中心的局部配位环境，进行了X射线吸收近边结构（XANES）和扩展X射线吸收精细结构（EXAFS）分析。Metazyme的Mn K边XANES谱与MnO非常匹配，表明Mn大多保持+2氧化态。EXAFS数据显示在4 ?以下有三个主峰。在Co K边，Metazyme的EXAFS谱在~2.2 ?处有一个主峰，表明Co-Co键是主要的配位结构。EXAFS拟合采用包含Co-N和Co-Co散射路径的三路径模型。拟合出的Co-Co路径配位数（N2 ≈ 3.3和N3 ≈ 2.9）明显小于块体Co4N的理论值，而Co-N配位数固定为2。这些结果表明，除了结晶Co4N框架外，一部分Co原子以高度分散的状态存在，缺乏扩展的Co-Co相互作用。这支持了孤立Co-Nx部分的存在，可能嵌入无序的碳/氮基质中或形成有缺陷的表面终端。这一结构解释与AC-STEM图像中观察到的离散亮点和亮簇一致。
综上，热解过程将MnPBA转化为具有分散Co和Mn活性位点的中空、多孔、部分石墨化结构。氮的掺入以及Co4N和MnO/MnO2相的形成，连同单原子分散，为Metazyme的双酶活性提供了坚实的结构基础。
2.2 Metazyme的催化能力
为了确定最有效的人工酶用于乳酸氧化，对其金属中心进行了优化。通过改变前体金属源，合成并热解了一系列具有不同中心金属离子的人工酶。其中，以Mn为中心的Metazyme表现出最高的乳酸消耗，表明其对乳酸具有优异的催化活性。为了进一步确认Metazyme的LOX样活性，定量评估了乳酸氧化产物丙酮酸的生成。
进一步研究了Metazyme在室温下乳酸氧化的动力学行为，揭示了乳酸消耗与乳酸浓度之间的强相关性，反应遵循典型的米氏动力学。最大初始反应速率（Vmax）计算为0.87 mM min-1（米氏方程）和0.56 mM min-1（Lineweaver-Burk），相应的米氏常数（KM）分别为27.96 mM（米氏方程）和22.45 mM（Lineweaver-Burk）。Metazyme的表现转换数（kcat, app）计算为0.128 s-1（米氏方程）和0.082 s-1（Lineweaver-Burk）。催化效率（kcat, app/KM）计算为4.58 M-1s-1（米氏方程）和3.67 M-1s-1（Lineweaver-Burk）。在50 μg mL-1的Metazyme剂量下也测量了乳酸氧化动力学，得到的KM和kcat, app与100 μg mL-1时处于同一数量级。
除了LOX样活性，Metazyme还表现出过氧化氢酶（CAT）样行为。测定了H2O2分解的动力学参数，Vmax值为0.18 mM min-1（米氏方程）和0.19 mM min-1（Lineweaver-Burk），KM值为9.44 mM（米氏方程）和12.43 mM（Lineweaver-Burk）。H2O2分解的kcat, app计算为0.027 s-1（米氏方程）和0.028 s-1（Lineweaver-Burk）。相应的催化效率（kcat, app/KM）为2.81 M-1s-1（米氏方程）和2.24 M-1s-1（Lineweaver-Burk）。在50 μg mL-1的减少剂量下，CAT样动力学给出的KM和kcat, app值进一步支持了内在金属归一化催化活性的稳定性。
为了验证其产氧能力，使用溶解氧探头监测了H2O2分解过程中的O2释放。在短时间内观察到快速的氧气释放，证实了Metazyme能够高效分解H2O2并持续产生氧气。这种自我维持的氧气供应支持乳酸氧化过程，并建立了双酶催化循环。
为了评估其性能，将Metazyme与商业天然LOX在不同反应条件下进行了比较。在pH 5时，Metazyme甚至表现出比天然LOX更高的催化效率，突出了其在弱酸性条件下作为乳酸氧化催化剂的优势。此外，在pH 5下评估了25°C、37°C和60°C时的乳酸消耗。天然LOX表现出强烈的温度敏感性，在37°C时活性最高，在60°C时活性大幅丧失，揭示了其热不稳定性。相比之下，Metazyme在所有测试温度下都保持稳定的活性，没有明显的温度依赖性。更重要的是，在所有测试条件下，它都持续优于天然LOX，表现出优异的热稳定性和环境适应性，适用于弱酸性条件。先前提出的用于Co4N/C纳米酶的乒乓机制很可能适用于本研究的Metazyme。
Metazyme的CAT样活性也通过与商业天然CAT在不同pH和温度条件下的H2O2分解性能比较进行了评估。在25°C下，评估了pH 5、7和9时的H2O2消耗。天然CAT和Metazyme都表现出明显的pH依赖性，Metazyme在弱碱性（pH 9）条件下活性最佳，在弱酸性（pH 5）条件下活性显著下降。进一步检查了CAT样活性在pH 9、25、37和60°C下的温度依赖性。天然CAT表现出强烈的热敏感性，在37°C时活性最高，在60°C时活性大幅丧失，表明酶变性。相比之下，Metazyme在所有测试温度下保持了几乎恒定的H2O2分解效率，没有表现出统计学上显著的温度依赖性。
因此，Metazyme将LOX样和CAT样活性集成到一个平台中，实现了pH自适应的级联反应，以协调调节乳酸和H2O2。在弱酸性条件下，Metazyme表现出主导的LOX样活性，导致乳酸快速氧化。重要的是，乳酸转化为丙酮酸伴随着酸负荷的净减少，这有助于缓解乳酸相关的酸中毒并逐渐提高局部pH。随着微环境向中性pH转变，Metazyme的CAT样功能逐渐增强。因此，Metazyme的CAT样活性使其能够高效分解产生的H2O2为O2，建立一个自我维持的O2循环，持续为乳酸氧化反应提供燃料。通过这种自然闭合、时间分辨的级联反应，Metazyme动态匹配了不断变化的伤口微环境，实现了对乳酸代谢、氧化还原稳态和氧气可用性的协调控制。
为了评估Metazyme的催化稳定性，使用同一批材料对LOX样和CAT样活性进行了循环催化测试。在两种反应的连续十个循环中，催化性能保持一致。LOX样活性在连续十个循环中保持良好，而CAT样活性观察到轻微下降，这可能是由于反应中间体的积累和重复暴露于氧化条件下的H2O2导致的部分表面钝化或活性位点阻塞。为了评估Metazyme在生理相关水溶液条件下的储存稳定性，检测了Metazyme在PBS中孵育7天后的催化活性，并与新鲜制备的样品进行比较，未观察到LOX样或CAT样催化活性的显著下降。为了进一步评估Metazyme在生理相关环境中的催化稳定性，检测了其在PBS、模拟体液（SBF）和补充了1 mg mL-1牛血清白蛋白（BSA）的SBF中的LOX样和CAT样活性。Metazyme在PBS和SBF中表现出相当的催化活性，表明离子组成和无机盐含量的变化不会明显影响其催化性能。相比之下，在存在蛋白质的情况下观察到催化活性适度下降。这种降低可能归因于蛋白质吸附在Metazyme表面，可能部分阻塞或屏蔽了暴露的催化金属位点，从而限制了底物可及性。
为了进一步评估Metazyme的底物特异性，评估了其在其他酶模拟反应中的活性。结果显示，在超氧化物歧化酶（SOD）样、氧化酶（OXD）样、过氧化物酶（POD）样、葡萄糖氧化酶（GOx）样和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）样反应中活性可忽略不计，表明Metazyme对乳酸和H2O2具有高底物选择性和催化特异性。
总之，Metazyme不仅对乳酸氧化表现出优异的催化效率，还具有强大的CAT样活性，能够持续产氧以支持自我维持的氧化循环。其在酸性和高温环境下优于天然LOX的性能，结合高底物特异性和双功能催化行为，突显了其作为复杂生理条件下代谢调节的多功能、强大人工酶的潜力。这些有利特性可能归因于其部分石墨化的碳框架、协同的Co-N和Mn-O活性位点的存在，以及其结构稳定的纳米结构。
2.3 用于封装Metazyme的棒状微凝胶的制备
为了实现生物学应用，将Metazyme嵌入由甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和氧化海藻酸钠（ox-SA）组成的生物相容性微凝胶载体中，通过苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基次膦酸锂（LAP）引发的光聚合交联。首先将Metazyme分散到水凝胶预聚物溶液中，随后注入微流体装置并在紫外照射下原位交联，形成负载Metazyme的微凝胶。未负载的棒状微凝胶也以相同程序制备用于比较，称为Rgel，而负载Metazyme的称为MetaRgel。选择GelMA和ox-SA是由于其优异的生物相容性和丰富的官能团，不仅支持细胞-材料相互作用，还有助于嵌入的人工酶的均匀分散和增强稳定性。通过1H核磁共振谱（NMR）表征了合成的GelMA的化学结构。ox-SA的化学结构也通过1H-NMR验证。使用微流体技术制造微凝胶以生成棒状结构。与球形微凝胶相比，棒状微凝胶已被报道可组装成具有各向异性和细长孔隙结构的支架，具有更大的有效孔径，有利于网络内的空气渗透和质量传输。此外，棒状微凝胶的组装体由于增强的颗粒间互锁而表现出更高的机械模量，从而在动态伤口环境中提供改进的结构弹性。这些特性作为透气且机械稳定的伤口敷料尤其有利，因为足够的氧气扩散和代谢物运输至关重要。通过将MetaRgel在PBS中孵育来评估其稳定性和嵌入Metazyme的滞留行为。对3天内收集的样品进行流式细胞术分析，结果显示与Metazyme相关的信号可忽略不计，表明从微凝胶基质中颗粒泄漏极少。由于其高比表面积，MetaRgel和Rgel在水中和PBS中都表现出高溶胀率。收集并
