《Advanced Science》：Cell Cycle-Specific Regulation of Centrosome Clustering Dynamics in Cancer Cells by the Multifunctional Kinesin HSET
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本篇研究性论文（非综述）系统性地揭示了驱动蛋白HSET在癌细胞中心体聚簇（clustering）与去聚簇（declustering）动态平衡中的多重调控功能。研究发现，HSET不仅通过捆绑微管促进纺锤体双极形成，还能与中心体蛋白CDK5RAP2形成共凝聚体，并将其主动运输至微管负端，从而驱动中心体材料的聚集与中心体融合。此外，HSET的ATP非依赖性自组装能稳定聚簇后中心体的结构完整性。该工作阐明了HSET在癌细胞周期各阶段调控中心体行为的全新分子机制，为其作为癌症治疗靶点提供了重要理论依据。
2 结果
2.1 癌细胞中的中心体在整个细胞周期中经历聚簇-去聚簇的转变
中心体在间期到有丝分裂的转换过程中会扩增以促进纺锤体组装。在U2OS和RPE1等非癌细胞系中，有丝分裂的中心体通常比间期中心体大，且各阶段内中心体大小相对均一。而在已报道发生中心体扩增的癌细胞系（如Hep3B和MDA-MB-231）中，间期和有丝分裂的中心体都表现出显著的尺寸异质性。值得注意的是，观察到了一个比有丝分裂对应物更大的间期中心体亚群，这表明中心体聚簇不仅发生在癌细胞的有丝分裂期，也发生在间期。
通过对中心体标志物CDK5RAP2、centrin以及细胞周期特异性标志物（cyclin D1/p21、cyclin A2、cyclin B1）进行共免疫荧光染色，发现Hep3B和MDA-MB-231细胞在所有细胞周期阶段都表现出多个中心体。定量分析显示，每个细胞周期阶段都有相当比例的细胞含有超过两个中心粒。这些结果说明，除了S期的经典中心体复制外，一部分额外的中心体来源于有丝分裂退出后的去聚簇。此外，在G1期细胞中，一部分单个中心体包含多个中心粒，表明间期也存在中心体聚簇现象。虽然大多数分析的CDK5RAP2灶点对centrin呈阳性，但也观察到了一小部分缺乏可检测中心粒的CDK5RAP2阳性灶点。这些发现支持了在这些癌细胞系中，存在有或无中心粒的不同中心体群共存，它们可能通过不同的机制（如PCM碎片化）产生。
接下来，建立了在鸡β-肌动蛋白启动子控制下稳定表达mStayGold标记的CDK5RAP2的Hep3B细胞系。活细胞成像显示，多个不同大小的CDK5RAP2灶点在M期之前的间期聚集成更少的斑点。这些CDK5RAP2灶点在有丝分裂期间进一步聚簇，并在细胞分裂后发生解离。这些发现共同表明，中心体的大小和数量在所有细胞周期阶段动态波动，意味着癌细胞中的中心体经历着连续的聚簇和去聚簇循环。
随后，使用荧光漂白恢复技术检查了癌细胞中CDK5RAP2的动态性。稳定的Hep3B细胞系表现出缓慢的恢复，漂白后仅达到原始荧光强度的约30%。恢复半衰期约为10秒，固定部分占70%。在非癌细胞RPE1中，CDK5RAP2也表现出低周转率和在中心体的有限恢复。这些结果表明，CDK5RAP2在癌细胞和非癌细胞中都表现出有限的动态性。
2.2 HSET依赖性中心体聚簇对于双极纺锤体形成和中心体完整性至关重要
接下来，应用了AZ82（一种阻断HSET ATP酶活性的抑制剂）以及进行了siRNA敲低，以抑制HSET在MDA-MB-231和Hep3B细胞中心体聚簇中的功能。对有丝分裂细胞的量化显示，AZ82处理显著增加了Hep3B和MDA-MB-231细胞中多极纺锤体的频率，但在U2OS或RPE1细胞中没有。同样，siRNA介导的HSET耗竭也导致两种癌细胞系中多极纺锤体数量相比siControl条件增加。尽管Hep3B和MDA-MB-231细胞表现出比RPE1细胞更高的HSET表达水平，但通过蛋白质印迹分析证实，HSET在两种癌细胞系中仍能被有效敲低。值得注意的是，在癌细胞系中，siRNA敲低或AZ82介导的HSET活性抑制均未改变总体CDK5RAP2蛋白水平。
除了纺锤体极数量的增加，AZ82和siRNA敲低处理都导致CDK5RAP2信号在间期和中期变得更加分散。这些散开的CDK5RAP2信号在两种癌细胞系的双极和多极纺锤体中均有观察到，尽管在Hep3B细胞的多极纺锤体中没有检测到显著差异。之前的研究表明，动力蛋白沿纺锤体微管运输聚集的NuMA到纺锤体极，抑制动力蛋白活性会阻止NuMA在极的积累。与此一致，我们的发现使我们提出，除了在有丝分裂期间滑动和捆绑微管以促进中心体聚簇和建立双极纺锤体外，HSET还能主动促进中心体材料在癌细胞纺锤体极的积累。重要的是，siRNA介导的HSET敲低导致两种细胞系中多极纺锤体的中心体体积与AZ82处理相比显著增加。这些差异表明，HSET超越其马达活性的功能可能有助于中心体聚簇或维持中心体完整性。
尽管进行了AZ82处理或siRNA介导的HSET敲低，间期或双极及多极纺锤体内含有超过两个中心粒的细胞百分比仍然相当。这些结果表明HSET不调控中心粒数量。相反，它们意味着在双极和多极纺锤体中观察到的分散CDK5RAP2信号来源于未能有效聚簇的扩增中心体。
2.3 CDK5RAP2在体外与HSET形成凝聚体
秀丽隐杆线虫的SPD-5先前已被证明可在体外形成选择性凝聚体。此外，植物中HSET同源物的聚簇可增强其持续性，促进逆向运输。为了从生化上表征CDK5RAP2是否形成凝聚体以及它是否能被HSET运输，我们应用了使用重组蛋白的体外重建系统。首先，我们在昆虫细胞中表达并纯化了带或不带荧光标签的单个HSET和CDK5RAP2蛋白，但全长GFP标记的CDK5RAP2的产量和质量相对较低。
AKAP450是一种定位于中心体和高尔基体的蛋白，其C端先前已被证明可与CDK5RAP2相互作用。重要的是，siRNA敲低或AZ82介导的HSET活性抑制均未改变任一种癌细胞系中的AKAP450蛋白水平，这与CDK5RAP2观察到的效果相似。此外，在两种处理条件下，AKAP450在MDA-MB-231细胞中保持与CDK5RAP2的细胞共定位。鉴于先前报道AKAP450可增强CDK5RAP2的细胞稳定性，我们将CDK5RAP2与AKAP450共表达以提高蛋白产量和质量。该策略产生了可溶且稳定的GFP标记全长CDK5RAP2与AKAP450 C端（氨基酸2767-3458）连接的异源二聚体。蛋白质印迹分析和质谱分析证实了两种蛋白的存在。
我们观察到GFP-CDK5RAP2-FL和GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD都能组装成微米尺度的凝聚体。由于GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD表现出更好的蛋白质质量，且AKAP450-CTD单独不形成凝聚体，我们使用GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD进行后续的凝聚体相关实验。添加聚乙二醇3350增加了凝聚体斑点的荧光信号强度、数量和密度。值得注意的是，用1,6-己二醇处理仅能最小程度地减少CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD凝聚体的形成。此外，相图分析显示GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD凝聚体形成依赖于盐浓度，表明静电相互作用对凝聚体组装有重要贡献。
此外，mCherry标记的HSET在PEG存在下与GFP-CDK5RAP2-FL和GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD形成共凝聚体，证实了它们的直接相互作用。FRAP分析显示，无论是否存在HSET，凝聚体中的GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD在漂白后仅部分恢复，这与在癌细胞中观察到的CDK5RAP2可逆但低动态的特性一致。对分配系数的进一步分析揭示了GFP和mCherry标记蛋白在凝聚体内的优先分配和相对共富集，支持了HSET和CDK5RAP2在这些组装体内的共分配和共存。
2.4 CDK5RAP2的N端卷曲螺旋区域介导凝聚体形成
为了确定负责凝聚体形成的CDK5RAP2区域，我们聚焦于该蛋白的N端一半，因为已知CDK5RAP2的C端参与中心体和高尔基体定位。我们生成了多个GFP融合的CDK5RAP2 N端片段。其中，GFP-CDK5RAP2 (248-530) 和 GFP-CDK5RAP2 (1-530) 能够稳健地形成凝聚体，其特点是在PEG存在下具有更高的荧光信号强度、更大的液滴尺寸和增加的斑点密度。相图和FRAP分析进一步证实GFP-CDK5RAP2 (1-530)凝聚体形成是盐依赖性的，并且GFP-CDK5RAP2 (1-530) 和 mCherry-HSET 表现出与GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD相似的可逆但低动态行为。生化表征显示CDK5RAP2 (1-530) 在尺寸排阻色谱中呈现尖锐的单分散峰，分析型超速离心沉降速度实验显示的分子量约为92 kDa。通过PSIPRED进行的蛋白质二级结构预测和通过AlphaFold3叠加五个预测的结构模型表明，CDK5RAP2从248到530残基的区域主要由α螺旋组成。这些发现表明，CDK5RAP2的N端卷曲螺旋区域（残基248-530）促进了凝聚体形成。因此，CDK5RAP2凝聚体形成是由长的N端卷曲螺旋二聚化区域内的静电相互作用介导的。
2.5 HSET将GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD凝聚体主动运输至微管负端
我们接下来采用TIRF显微镜获取了在HSET存在下，单个微管上GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD分布的静态图像。单独使用GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD呈现微弱的荧光信号，这些信号沿固定在盖玻片上的GMPCPP稳定的微管分布。在不添加ATP的情况下，将GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD与HSET孵育，以HSET浓度依赖的方式增加了微管上的GFP荧光信号强度。这些结果支持两个关键点：1) GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD和HSET在微管上的结合位点不重叠；2) HSET延长了GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD在微管上的停留时间。值得注意的是，当GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD和HSET在ATP存在下与单个微管丝孵育时，我们观察到在微管末端形成了微米级的积聚。单独的GFP-HSET在ATP存在下对微管结合没有偏好性。因此，ATP依赖的HSET活性对于将GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD靶向到微管并使其在其末端形成微米级积聚是必不可少的。
我们可视化了在HSET存在下，极性标记的微管上荧光GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD的定位。GFP-HSET在ATP存在下均匀地结合在微管丝上。然而，在相同的实验条件下，荧光的GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD特异性地积聚在由X-罗丹明标记的微管负端，表明HSET促进了荧光GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD在微管负端的定位。
为了确定GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD是否能在微管依赖性运输测定条件下形成凝聚体并被主动运输，在含有1x BRB80的缓冲液中检查了GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD。与先前的观察一致，无论是否存在HSET，GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD也能组装成显示出低内在动态性的微米级凝聚体。接下来，我们进行了荧光延时成像以评估凝聚体动态。在HSET存在下，GFP-CDK5RAP2-FL或GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD的延时序列表明，积聚过程始于微管末端并向细丝的另一端扩展。kymographs说明了不同荧光强度的GFP标记的凝聚体在微管末端的连续运输和融合，导致斑点积聚增加。对凝聚体运动的量化显示，GFP-CDK5RAP2-FL的平均速度为5.5 ± 1.6 × 10-2μm/s，GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD为8.7 ± 1.5 × 10-2μm/s。需要注意的是，在AZ82存在下，kymograph分析显示GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD凝聚体仍然与微管结合，但无法移动。这些结果表明，尽管凝聚体仍能与微管结合，但AZ82抑制了HSET依赖的运输活性。
在相同条件下，CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD和GFP-HSET的延时序列也显示GFP荧光信号在微管末端积聚。尽管很大比例的GFP-HSET结合在微管上而没有末端积聚，但我们确实观察到GFP信号沿微管向其末端的连续流动，其速度与测定的GFP-CDK5RAP2移动速度相当。GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD凝聚体的平均移动距离为7.4 ± 1.9 μm，覆盖了我们实验中使用的微管长度的相当大比例。值得注意的是，HSET介导的运输速度并未随着GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD凝聚体尺寸的增加而降低，使得这种运输机制能够有效地递送大货物。
接下来，我们应用了三色TIRF成像，使用GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD、mCherry-HSET和HiLyte-647标记的微管。延时序列的kymograph分析揭示了GFP和mCherry荧光信号的共线对角轨迹，证实了GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD和HSET沿着微管共同向末端迁移。值得注意的是，在相同的采集条件下，单独的mCherry-HSET并未表现出向微管末端的对角轨迹。然而，当使用更短的采集间隔成像时，可以检测到短暂的、非定向的过程性事件。总之，这些发现表明，末端积聚是通过HSET将CDK5RAP2凝聚体定向运输到微管负端而发生的。
2.6 CDK5RAP2的N端介导HSET依赖性运输
先前的下拉实验表明，CDK5RAP2的300-700残基与HSET相互作用。由于我们已经证明GFP-CDK5RAP2 (248-530) 和 GFP-CDK5RAP2 (1-530) 形成凝聚体，我们进行了基于TIRF的测定，以确定这些构建体形成的液滴是否也能被运输到微管末端。与含有CDK5RAP2-FL的凝聚体类似，GFP-CDK5RAP2 (248-530) 和 GFP-CDK5RAP2 (1-530) 在HSET和ATP存在下也在微管末端积聚。此外，两种截短构建体被HSET递送的速度和移动距离与含有CDK5RAP2-FL的凝聚体相当。此外，kymographs显示GFP-CDK5RAP2-FL和两种截短构建体经常表现出扩散事件，而GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD则很少观察到。在这四种测试的构建体中，GFP-CDK5RAP2-FL•AKAP450-CTD表现出最高频率的过程性运输事件，表明全长CDK5RAP2与额外的结合伙伴一起增强了HSET依赖性运输的效率。值得注意的是，我们的kymographs显示，除了在微管末端融
