《Meat Science》：Calcium and calpastatin delay proteolysis early during beef maturation
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牛肉宰后早期嫩化过程中，钙离子和calpastatin对calpain-1自解及蛋白降解的调控作用。通过体外消化实验分析不同宰后时间（0、1、2、7、14天）牛背最长肌（LTL）和浅侧腕屈肌（ER）的calpain-1亚基（80kDa→76kDa）自解动态、calpastatin含量及钙离子影响，发现0和1天LTL在无外源钙时保留较高完整calpain-1（P<0.001），而添加钙显著促进自解（P<0.001）；1天LTL钙处理组desmin降解率提升（P<0.027）。calpastatin在1天LTL中仅存25%，而ER肌2天内仍保留50%。研究表明，宰后24小时内钙离子可利用性及calpastatin水平是调控calpain-1活性和肌肉蛋白降解的关键因素，存在肌种特异性差异。
J.S. Bodmer | M. Beline | C.N. Yen | M. Zumbaugh | J.C. Wicks | E.C. Roth | J. Chen | M. Koohmaraie | S. Matarneh | T.H. Shi | S.L. Silva | D.E. Gerrard
密西西比州立大学动物与乳品科学系，美国密西西比州39762
摘要
本研究采用体外蛋白水解方法，进一步探讨了牛肉早期成熟过程中钙蛋白酶介导的蛋白质分解现象。我们测量了死后0天、1天、2天、7天和14天的Longissimus thoracis et lumborum (LTL)和Extensor carpi radialis (ER)肌肉中钙蛋白酶-1的自溶情况以及calpastatin的含量。将样品研磨成粉末后加入肌原纤维中，进行体外消化实验。在孵育0小时、120小时、480小时和144小时时分别采集样本，测定钙蛋白酶-1的自溶程度、calpastatin的含量以及desmin的降解情况。为了研究游离钙对体外蛋白质分解的影响，我们在LTL肌肉中添加了钙。在未添加钙的情况下，0天时的LTL样品中80 kDa钙蛋白酶-1的完整性较高（P < 0.001）；而在含有7天或14天LTL的样品中，76 kDa亚基的比例最高（P < 0.001）。在添加钙的情况下，0天和1天的LTL样品中80 kDa亚基的自溶程度增加（P < 0.001）。添加钙后，1天LTL样品中的desmin降解程度显著增强（P < 0.027），而0天LTL样品中则没有这种变化。大约25%的calpastatin在1天LTL样品中仍然保持完整，而在ER肌肉中，50%的calpastatin在2天后仍保持完整。这些结果表明，在死后24小时内，钙的可用性和calpastatin的水平可能以肌肉依赖的方式限制钙蛋白酶-1的活性。
引言
牛肉的嫩度是影响消费者满意度的最重要因素之一（Huff-Lonergan, Parrish Jr, & Robson, 1995; Miller, 2020; Miller, Carr, Ramsey, Crockett, & Hoover, 2001）。牛肉不同部位之间的嫩度差异仍然是牛肉产业面临的一个重大挑战。尽管已经取得了一些重要发现，并据此制定了多种提高牛肉嫩度的策略（Warner et al., 2022），但对于引发死后蛋白质分解的机制仍缺乏清晰的认识，尤其是在牛肉成熟过程的最初阶段，此时蛋白酶的激活可能对肉质软化具有积极作用。钙蛋白酶-1是一种依赖钙的半胱氨酸蛋白酶，大量研究表明它是死后蛋白质分解的主要驱动因素，最终促进肉质的软化（Geesink, Kuchay, Chishti, & Koohmaraie, 2006）。在细胞内钙水平升高的情况下，钙蛋白酶-1会发生自溶，首先形成78 kDa的亚基，最终生成76 kDa的亚基（Thompson, & Goll, 2004）。完全自溶的钙蛋白酶-1会攻击多种肌原纤维蛋白，破坏肌肉结构，从而降低组织剪切所需的力，使肉质更加柔软（Geesink et al., 2006; Whipple, Kretchmar, Crouse, & Mersmann, 1991; Morgan, Wheeler, Koohmaraie, Savell, & Crouse, 1993）。尽管相关机制在文献中已有较为详细的描述（Geesink et al., 2006; Koohmaraie, 1988; Koohmaraie, 1992a, Koohmaraie, 1992b; Koohmaraie, 1994; Koohmaraie & Geesink, 2006; Koohmaraie, Seidemann, Schollmeyer, Dutson, & Crouse, 1987; Morgan et al., 1993），但仍存在一些未解之谜。例如，有人认为钙蛋白酶的激活等同于自溶（Goll, Thompson, Li, Wei, & Cong, 2003），而另一些人则认为未自溶的钙蛋白酶-1（80 kDa）仍具有蛋白水解活性（Cong, Goll, Peterson, & Kapprell, 1989; Goll, Thompson, Taylor, & Zalewska, 1992; Molinari, Anagli, & Carafoli, 1994）。最近，我们开发了一种体外蛋白水解检测方法，使用纯化的肌原纤维作为底物，并研究了老化牛肉中这种蛋白酶的体内调节机制（Bodmer et al., 2025）。虽然这些实验结果再现了成熟过程中完整肌肉中的观察现象，但也引发了一些问题：首先，实验期间未检测钙蛋白酶的自溶过程；其次，即使将样品在室温下保存24小时，0天和1天老化的肌肉样品也几乎没有发生蛋白质分解；最后，实验期间未监测游离钙的水平，这可能导致在较长时间老化的肌肉样品中钙含量升高，从而激活了钙蛋白酶-2。因此，本研究的目的是利用两周老化的牛肉样品，通过体外实验监测钙蛋白酶-1的自溶情况、calpastatin的含量以及钙的水平。我们认为，通过体外检测肌原纤维特异性蛋白质分解变化，可以深入了解牛肉早期软化过程中钙蛋白酶介导的机制。
动物和肌肉采样
本研究使用的牛（数量≥6头）及肌肉样本均来自之前的采集。这些牛是根据行业标准在弗吉尼亚理工大学肉类科学与教学中心宰杀的。Longissimus thoracis et lumborum (LTL)和Extensor carpi radialis (ER)肌肉样本分别在死后0天、1天、2天、7天和14天采集（Bodmer et al., 2025）。
实验设计和处理组
本研究采用了对照平行实验设计来研究肌肉中蛋白质分解的演变过程。
LTL和ER肌肉样本的时间点
图1A和B显示，在14天的牛肉老化过程中，LTL肌肉中80 kDa钙蛋白酶亚基逐渐减少（P < 0.001）。如预期，0天时的样本中仅含有完整的80 kDa钙蛋白酶亚基；然而到1天时，该亚基的含量降至50%以下；到2天、7天和14天时，几乎检测不到该亚基，仅剩少量的未自溶钙蛋白酶-1。图1C显示相应情况下钙蛋白酶亚基含量的增加（P < 0.001）。
讨论
我们利用体外消化系统发现，可以重现成熟过程中完整牛肉肌肉中的蛋白质分解现象（Bodmer et al., 2025），并且这一发现与其他研究结果一致（Cruzen, Paulino, Lonergan, & Huff-Lonergan, 2014; Koohmaraie, 1992a, Koohmaraie, 1992b; Wright et al., 2018）。然而，我们的结果也对钙蛋白酶-1在体内的自溶情况以及早期为何没有蛋白质分解提出了疑问。
结论
通过体外实验使用纯化的肌原纤维和研磨组织，我们发现牛肉肌肉中的死后蛋白质分解受到0天和1天LTL组织中游离钙含量的限制，这影响了钙蛋白酶-1的自溶和蛋白质分解。添加100 μM CaCl?后，自溶和蛋白质分解程度增加，表明钙蛋白酶-1是本实验中的主要蛋白水解酶。此外，即使在添加了钙的情况下，0天LTL组织中也没有观察到蛋白质分解。
CRediT作者贡献声明
M. Beline：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、概念构建。
C.N. Yen：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、概念构建。
M. Zumbaugh：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、概念构建。
J.C. Wicks：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、方法学设计、概念构建。
E.C. Roth：方法学设计。
未引用的参考文献
Voges et al., 2007
利益冲突声明
本文“钙和calpastatin延缓牛肉成熟早期的蛋白质分解”尚未提交给任何其他期刊发表。所有作者均已批准最终稿件，并参与了工作的各个环节，以确保其顺利完成。
