《Microchemical Journal》：An autocatalytic exponential signal amplification strategy via topologically regulated CRISPR/Cas12a for rapid and sensitive antibody detection
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本研究开发了一种新型荧光检测方法，结合拓扑受限的DNA dumbbell结构和CRISPR/Cas12a技术，实现抗地高辛抗体的高灵敏度检测（LOD为1.71 pM），并克服传统方法的局限性，具有优异特异性和复杂生物样本适用性。
Jirong Yang|Qian Xiang|Wenjiao Zhou|Xuemei Sang
重庆理工大学化学与化学工程学院，中国重庆400054
摘要
准确监测人体血清中的抗体水平对于评估免疫反应和诊断感染至关重要。然而，传统的抗体检测方法在灵敏度、特异性和实用性方面往往存在局限性，因此需要开发更先进的分析平台。我们开发了一种新型荧光方法来检测抗地高辛（Anti-Dig）抗体，该方法将拓扑受限的DNA哑铃结构与CRISPR/Cas12a技术相结合。DNA哑铃探针包含双链DNA（dsDNA）环，这些环物理上限制了Cas12a的活性，有效抑制了顺式和反式切割，从而确保背景荧光最小化。这种独特的设计能够精确调控CRISPR/Cas12a的反式活性，实现超灵敏检测。当目标抗体引入时，Anti-Dig抗体介导的dsDNA复合物会引发趾抓链置换反应，将受限的环结构转化为含有PAM序列的线性dsDNA。这些线性dsDNA能高效结合CRISPR/Cas12a，激活其反式切割活性。值得注意的是，激活的反式切割活性会在其他拓扑环上切割3个核苷酸（nt）的单链DNA（ssDNA），使其线性化，并触发Cas12a的自催化指数信号放大模式。该方法实现了对Anti-Dig抗体的超灵敏检测，检测限低至1.71 pM。该方法还对Anti-Dig抗体具有优异的选择性，并能准确量化复杂生物样本中的抗体水平。这种方法为分子诊断提供了一种具有卓越灵敏度和特异性的强大工具，为超灵敏生物分析提供了一种可靠且通用的方法。
引言
抗体是一类免疫球蛋白，是免疫系统的重要组成部分，通过特异性识别和结合抗原来提供对感染的保护[1]，[2]。其中，Anti-Dig抗体因与地高辛（一种广泛使用的心脏药物）的狭窄治疗指数相关而具有特殊的临床意义。准确检测Anti-Dig抗体对于临床管理至关重要，包括监测免疫反应、评估药物疗效和安全性以及识别潜在的免疫不良反应[3]。酶联免疫吸附测定（ELISA）[4]、免疫荧光[5]、[6]、Western blot[7]和流式细胞术[8]是常用的抗体检测方法。然而，这些方法通常存在成本高、操作复杂以及需要专业技术知识的局限性。因此，人们越来越关注开发能够解决这些问题的创新检测技术。例如，Francesco Ricci及其同事[9]引入了一种无细胞转录开关用于抗体检测，该方法利用特定抗体激活的DNA可编程模块来启动RNA适配体的转录。类似地，Larysa等人[10]开发了一种基于交叉金纳米线的阻抗纳米生物传感器来检测SARS-CoV-2抗原，展示了其高灵敏度和临床适用性。尽管这些方法在灵敏度、特异性和操作简便性方面取得了显著进展，但成本和实施复杂性方面的挑战依然存在。因此，仍然需要结合高灵敏度和特异性、同时具备经济性和易用性的新型检测方法。这样的进步将有利于临床和研究领域，解决现有局限性并扩展抗体检测技术的应用范围。
基因工程通过CRISPR系统得到了显著发展，该系统利用RNA引导的Cas蛋白实现对DNA序列的精确靶向和编辑[11]，[12]。其中，CRISPR-Cas12a系统因其能够切割双链和单链DNA的双重能力而成为一种重要的分子诊断工具[13]，[14]。例如，基于Cas12a的平台已被应用于多种应用，如用于细胞成像的RNA激活纳米机器人[15]，以及通过逆转录结合扩增方法（如重组酶聚合酶扩增（RPA）、聚合酶链反应（PCR）和环介导等温扩增（LAMP）[16]，[17]，[18]进行RNA检测。尽管这些方法在灵敏度、特异性和操作简便性方面取得了显著进展，但仍存在一些挑战。其中一个主要问题是脱靶活性，这可能导致非特异性DNA切割，从而影响检测的准确性和可靠性[19]，[20]，[21]。另一个关键挑战在于等温扩增和CRISPR系统在一步检测中的固有不兼容性。具体来说，Cas12a的强大切割活性会破坏扩增模板（扩增子）和引物，导致扩增效率降低和检测灵敏度减弱[22]，[23]，[24]。Yang等人[25]通过引入一种光诱导的CRISPR-Cas12a平台（POIROT）来应对这些挑战，该平台将RPA与化学修饰的crRNA结合。这一策略减轻了反应不兼容性，实现了与定量PCR（qPCR）相当的检测灵敏度，并且结果更快。这种方法为基于Cas12a的方法在广泛而深入的生物传感应用中开辟了新的途径。之后，Wu及其同事[26]巧妙地利用环状CRISPR RNA（circular crRNA）来调节CRISPR/Cas12a系统的激活，创新性地模拟了拓扑屏障在基因组中的作用，从而实现了一种高灵敏度和特异性的新生物传感平台。同时，Deng及其同事[27]进一步发现，小环状DNA纳米结构可以大大抑制Cas12a的活性，从而构建了一种用于DNA的指数信号放大检测技术。
为了解决传统线性CRISPR诊断方法的固有灵敏度限制，我们开发了一种使用可编程DNA哑铃探针的新型生物传感平台。与标准CRISPR检测方法不同，其中单个激活的Cas12a线性切割报告分子，我们的设计引入了一个由拓扑受限的DNA哑铃探针驱动的正反馈循环。工程化的DNA哑铃探针包含两个双链（dsDNA）环，这些环携带crRNA识别序列，形成拓扑屏障以将PAM序列隔离在环结构内，从而抑制CRISPR/Cas12a/dsDNA复合物的形成。这种设计有效抑制了CRISPR/Cas12a的活性，在没有Anti-Dig抗体的情况下产生最小背景信号。当Anti-Dig抗体引入时，目标抗体介导的TSDR使dsDNA环线性化，允许CRISPR/Cas12a结合并随后激活反式切割。激活的CRISPR/Cas12a系统的反式切割活性可以进一步切割其他拓扑环中的3个核苷酸（nt）单链DNA（ssDNA），将其转化为线性化的dsDNA，从而启动自催化指数放大模式。
部分摘录
化学品和材料
绵羊多克隆Anti-Dig抗体、小鼠单克隆抗二硝基苯（Anti-DNP）抗体、小鼠单克隆抗人类免疫缺陷病毒（Anti-HIV）抗体和人免疫球蛋白G（IgG）购自Sigma-Aldrich有限公司（中国上海）。LbCas12a和NEBuffer r2.1（50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl2、100 μg/ml重组白蛋白，pH 7.9）购自New England Biolabs公司（中国北京）。ELISA检测试剂盒由Jining Biotech有限公司提供。用于检测Anti-Dig抗体的Cas12a指数信号放大机制
用于检测Anti-Dig抗体的提出的自催化Cas12a指数信号放大机制如图1所示。可编程的DNA哑铃拓扑探针包含两个稳定的双链DNA（dsDNA）环，每个环中包含一个原间隔序列（PAM，红色区域）和一个短单链DNA（3-nt）序列（黄色）。在没有目标抗体的情况下，这两个环形成拓扑屏障，抑制Cas12a的激活，因此没有结论
总之，本研究通过构建一种结合拓扑DNA调控的自催化Cas12a指数信号放大系统，建立了一种超灵敏生物传感的新分析方法。与传统“一个目标一个Cas12a”激活模式不同，我们的策略成功构建了一个自我维持的反馈循环，其中Cas12a的反式切割活性既作为信号生成器又作为放大驱动器。
CRediT作者贡献声明
Jirong Yang：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据管理。Qian Xiang：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据管理。Wenjiao Zhou：撰写——审稿与编辑、验证、资源获取、项目管理、资金筹集、概念构思。Xuemei Sang：监督、实验设计、正式分析。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了国家自然科学基金（编号：22004010）、重庆市教育委员会科学技术研究计划（编号：KJQN20230111）、重庆市科学技术委员会（编号：2023NSCQ-MSX1563）以及重庆市研究生研究与创新项目（编号：CYS25772）的资助。
