《Microchemical Journal》：CRISPR/Cas-based biosensors: applications for early diagnosis of cardiovascular disease
编辑推荐：
心血管疾病早期检测中CRISPR/Cas结合生物传感器的技术原理、应用现状及挑战分析。
Zahra Jamalizadeh Bahaabadi|Prashant Kesharwani|Sercan Karav|Amirhossein Sahebkar
伊朗马什哈德医科大学药学技术研究所生物技术研究中心
摘要
心血管疾病（CVDs）是全球主要的健康问题之一，具有较高的死亡率。通过心血管生物标志物（如nTnI和BNP）早期检测这些疾病对于减少CVDs的并发症至关重要。因此，开发先进的诊断方法和生物传感器受到了广泛关注。将 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) 和 CRISPR-associated protein (CRISPR/Cas) 技术（这两种知名的基因编辑工具）与生物传感器结合，已成为创建一种创新技术的重要步骤，该技术能够灵敏、准确、快速且早期地检测分子和生物标志物，尤其是心血管生物标志物。许多研究表明，CRISPR/Cas 技术可以与生物传感器结合，用于检测核酸链或多种蛋白质和脂质生物标志物。本文旨在研究基于 CRISPR/Cas 的生物传感器在早期检测心血管疾病方面的性能，包括利用荧光、比色和电化学方法结合 CRISPR/Cas 12a 和 CRISPR/Cas 13a 系统检测不同临床样本（血浆和血清）及细胞培养物中各种心血管疾病生物标志物的限值和检测范围。此外，还讨论了心血管生物标志物检测面临的挑战和局限性，以及这些基于 CRISPR/Cas 的生物传感器的临床应用潜力。
引言
根据世界卫生组织（WHO）的数据，心血管疾病（CVD）每年导致全球超过1900万人死亡，是主要的死亡原因之一 [1]。这些疾病的发生与不良饮食、吸烟、年龄、缺乏运动和遗传因素等风险因素有关 [2]。动脉粥样硬化、心肌梗死、冠状动脉疾病、心力衰竭和心脏病发作是其中的一些病症 [3]。早期诊断这些疾病对于降低死亡率并提高患者生活质量至关重要，因为这可以及时进行医疗干预 [4]。心电图（ECG）[5] 和基于酶或抗体的血液检测（测量心脏肌钙蛋白 I (cTnI)、脑利钠肽 (BNP) 或载脂蛋白 B (apoB) 等生物标志物）是诊断心血管疾病的传统方法 [6]。这些方法通常依赖于免疫测定（如酶联免疫吸附测定 (ELISA) [7]）或色谱技术（如高效液相色谱 (HPLC) [8]）。尽管这些方法较为准确，但由于其局限性（需要复杂的实验室设备、训练有素的人员、耗时的结果和高成本）[9]，仍显示出对新的诊断程序的需求 [10]。此外，医疗系统的一个关键前提是能够以极高的灵敏度早期识别生物标志物 [11]。在这方面，结合尖端技术的生物传感器可以实现快速、精确、灵敏且经济的血管生物标志物检测 [12]。
下一代生物传感器可以使用先进的基因工程工具（如 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) [13]）来创建。CRISPR 最初是为基因编辑开发的，但现在也被用于生物传感器中，以准确检测蛋白质、代谢物和核酸 [14]。基于 CRISPR 的生物传感器利用 CRISPR/Cas 系统（特别是 Cas9、Cas12a 和 Cas13a）来识别特定的生物标志物。这些生物传感器通过 Cas 酶进行靶向切割，产生可检测的输出，如颜色变化、电化学信号或荧光 [15]。例如，可以使用 DNA 内切酶靶向 CRISPR 报告系统 (DETECTR)（结合 Cas12a）或特定高灵敏度酶报告系统 (SHERLOCK)（结合 Cas13a）以飞摩尔级灵敏度检测 microRNA (miRNAs) 或突变 DNA [16]。由于其显著优势（包括高特异性（由精确的 CRISPR RNA (crRNA) 配对实现）、极高的灵敏度（能够检测单个分子）、易于使用以及与便携设备的兼容性 [17]、[18]，这些生物传感器非常适合在非实验室环境中进行快速诊断。此外，基于 CRISPR/Cas 的生物传感器正迅速成为检测少量生物体液样本中多种疾病生物标志物和微生物的强大平台 [19]。然而，在包括血清和血浆在内的样本中检测生物标志物可能具有挑战性，因为基质复杂性和其他物质的干扰会显著影响检测灵敏度和重复性 [20]、[21]。然而，最近基于 CRISPR/Cas 的生物传感器的发展表明，这一诊断平台可用于早期癌症检测 [22]、病毒感染监测 [23] 和蛋白质标志物检测，即使样本制备量很少，检测限也可在飞摩尔 (fM) 到阿摩尔 (aM) 之间 [24]。基于 CRISPR 的生物传感器已被用于诊断心血管疾病，特别是检测关键的心血管生物标志物（如蛋白质 (cTnI、BNP 等)、代谢物（如 ATP，表明心肌缺血中的线粒体功能障碍）和 miRNAs (miR-499)）。
本文旨在全面探讨基于 CRISPR/Cas 的生物传感器的最新发展及其在心血管疾病诊断中的应用。首先将介绍心血管疾病及其用于诊断的生物标志物。随后部分将讨论这些生物传感器的技术原理、用于检测心血管生物标志物的策略以及未来面临的挑战。
部分摘录
心血管疾病和生物标志物
由心脏和血管组成的心血管系统容易受到各种疾病的影响 [25]。在全球范围内，CVD 是最重要的死亡原因之一，占疾病总数的很大比例 [26]。某些类型的心血管疾病包括心绞痛（胸痛）、心力衰竭 (HF)、心肌缺血、动脉粥样硬化、急性心肌梗死 (AMI)、病毒性心肌炎、心脏瓣膜疾病和心肌病 [27]。由于以下因素，患这些疾病的风险会增加：
基于 CRISPR/Cas 的生物传感器
CRISPR 系统于 1987 年首次被发现 [69]。它是一种存在于许多细菌和古菌中的基因序列，作为一种防御机制，涉及 CRISPR 和 Cas 蛋白质。作为一种基因编辑策略，CRISPR/Cas 可以通过引导 RNA 靶向特定区域来切割核酸并防御外来基因 [70]。CRISPR-associated protein (Cas) 系统使用 crRNA 来指导 Cas 酶识别和切割核酸目标 [71]。crRNA 是一种简短的
结论与未来方向
本综述的主要目的是概述基于 CRISPR/Cas 的生物传感器技术在心血管疾病诊断中的应用。寻求医疗服务的延迟会显著影响患者的病情和长期健康状况。早期或及时的疾病诊断有助于减少这种情况。因此，识别指示疾病病理生理状态的标志物是非常重要的。这一目标通过开发高灵敏度的生物传感器得以实现
CRediT 作者贡献声明
Zahra Jamalizadeh Bahaabadi：撰写 – 原始草稿。Prashant Kesharwani：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念构思。Sercan Karav：撰写 – 原始草稿。Amirhossein Sahebkar：撰写 – 审稿与编辑、监督、概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
