《Food Science & Nutrition》：Identification of Citri Reticulatae Pericarpium (Chenpi) From Different Cultivars via LC–MS/MS and UPLC Coupled With Multivariate Chemometrics Analysis
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本文通过LC-MS/MS与UPLC-多元化学计量学分析，系统比较了7种陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium, CP）栽培品种的化学特征，建立了基于9种黄酮类化合物的快速定量鉴别方法。研究证实，广陈皮（GCP）中橙皮素（hesperetin）可作为品种特异性标志物，而主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）与层次聚类分析（HCA）可有效区分各品种。该方法为陈皮的质量控制、临床安全使用及深入研究提供了可靠、高效的技术支撑。
引言
陈皮（Citri Reticulatae Pericarpium, CP），又称陈皮，是芸香科柑橘（Citrus reticulataBlanco）及其栽培品种的干燥果皮，广泛应用于治疗呼吸与消化系统疾病。现代研究表明，陈皮具有抗氧化、抗癌、抗肥胖及抗菌等多种生物活性。其主要的活性成分包括挥发油和黄酮类化合物，后者又可分为黄酮苷和多甲氧基黄酮（PMFs），这些成分不仅贡献了其独特香气，也增强了其药效。然而，不同来源的陈皮栽培品种在产地、品质和价格上存在显著差异。特别是广东新会产的广陈皮（GCP，C. reticulata“Chachi”）因其品质上乘、需陈化三年以上使用而价格高昂，但产量有限。市场调查显示，除药典记载的品种外，还有许多其他柑橘栽培品种被用于陈皮生产，如茶枝柑（GCP）、大红袍（DHP，C. reticulata“Dahongpao”）、温州蜜柑（WZMG，C. reticulata“Unshiu”）等。这些品种的化学成分差异直接影响其药用价值和营养品质，但目前缺乏可靠、高效的方法来区分这些主要市售品种，这对陈皮的质量控制和临床安全应用构成了挑战。传统的形态学鉴别方法在陈皮晒干、切制后难以适用，而基于DNA的方法又因柑橘品种杂交的复杂性而面临挑战。因此，开发一种简单有效的分类方法对于确保陈皮质量至关重要。
实验部分
材料与试剂：本研究共收集了7个陈皮栽培品种的70批次样品（每个品种10批），包括茶枝柑（GCP）、大红袍（DHP）、温州蜜柑（WZMG）、椪柑（PG，C. reticulata“Ponkan”）、南丰蜜桔（NFMJ，C. reticulata“Kinokuni”）、蕉柑（JG，C. reticulata“Tankan”）和本地早（BDZ，C. reticulata“Succosa”）。GCP样品采自广东新会，其余品种样品则由相应栽培品种的新鲜果实制得。所有样品均经暨南大学药学院马志国教授鉴定，凭证标本存放于暨南大学中药标本馆。样品详细信息见表1，代表性样品图片见图1。化学对照品（纯度>97%）包括柚皮芸香苷（narirutin）、橙皮苷（hesperidin）、香风草苷（didymin）、橙皮素（hesperetin）、甜橙黄酮（sinensetin）、川陈皮素（nobiletin）、3′,4′,3,5,6,7,8-七甲氧基黄酮、橘皮素（tangeretin）和5-去甲基川陈皮素（5-demethylnobiletin）。
LC-MS/MS分析：采用加热回流法（50 mL 100% 甲醇，提取60分钟）制备样品。使用配备Q-Exactive轨道阱质谱仪的Thermo Vanquish UPLC系统进行分析。色谱分离在Waters Acquity UPLC BEH C18柱上进行，流动相为0.1%甲酸水溶液和乙腈，采用梯度洗脱。质谱参数设置为正离子模式。原始数据通过Compound Discoverer软件进行处理，化合物鉴定结合了mzCloud、mzVault数据库及文献报道。
UPLC分析：基于LC-MS/MS结果，选取了9种在品种间差异显著的黄酮类化合物，建立了一种简化的UPLC定量方法。使用Waters ACQUITY UPLC系统，搭配HSS T3色谱柱和二极管阵列检测器。柚皮芸香苷、橙皮苷、香风草苷和橙皮素的检测波长为283 nm，甜橙黄酮、川陈皮素、3′,4′,3,5,6,7,8-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-去甲基川陈皮素的检测波长为330 nm。流动相同样为0.1%甲酸水溶液和乙腈。该方法在22分钟内实现了9种化合物的基线分离。
方法验证：对所建立的UPLC定量方法进行了全面的验证，包括线性、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、精密度（日内、日间）、稳定性、重复性和加样回收率。结果表明，所有9种化合物在测试浓度范围内均表现出良好的线性（r> 0.999），LOD和LOQ分别在0.0379-0.152 μg/mL和0.114-0.456 μg/mL之间。日内、日间精密度RSD分别低于0.88%和0.79%，重复性RSD在1.06%到2.05%之间，样品在3天内稳定性良好（RSD < 2.06%），加样回收率在96.32%到101.4%之间，证明了该方法的高灵敏度、精密度、稳定性和准确性。
数据分析：基于9种黄酮类化合物的定量数据，使用SIMCA 14.1软件进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA），以区分7个陈皮栽培品种。同时，使用Ward法和平方欧氏距离在线平台进行层次聚类分析（HCA），根据黄酮含量对品种进行分类。
结果与讨论
化学成分鉴定：LC-MS/MS分析共鉴定出7个陈皮品种中的53种化合物，包括48种黄酮类化合物、2种生物碱、2种柠檬苦素类似物和1种香豆素，证实黄酮类是陈皮的主要成分。其中，橙皮苷、柚皮苷、甜橙黄酮、川陈皮素和橘皮素等代表性化合物与既往报道一致。根据峰面积在品种间的显著差异以及对照品的可得性，最终选取了上述9种黄酮类化合物用于后续的UPLC定量分析。
方法优化：通过系统评估提取方法、溶剂、时间和体积，确定了最佳样品前处理条件为：50 mL 100% 甲醇加热回流提取60分钟。色谱分离优化后，采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱，以0.1%甲酸水-乙腈为流动相，在优化条件下，9种目标化合物实现了基线分离，混合对照品及7个品种样品的色谱图见图2。值得注意的是，橙皮素仅在GCP样品中被检测到。
9种黄酮类化合物的定量与多元分析
定量分析：对70批样品进行分析发现，柚皮芸香苷、橙皮苷、香风草苷、甜橙黄酮、川陈皮素、3′,4′,3,5,6,7,8-七甲氧基黄酮、橘皮素和5-去甲基川陈皮素在所有样品中均有检出，而橙皮素仅在GCP中可定量。9种黄酮（GCP为9种，其余为8种）的总含量在36.24至88.64 mg/g之间，其中DHP的总含量最高。橙皮苷是含量最丰富的化合物，占总黄酮含量的71%至92%。各品种呈现出独特的黄酮谱，例如WZMG含有较高浓度的柚皮芸香苷但多甲氧基黄酮含量较低；JG的橙皮苷含量较低，但香风草苷和3′,4′,3,5,6,7,8-七甲氧基黄酮含量较高。在中国药典中，橙皮苷、川陈皮素和橘皮素被指定为陈皮的质量标志物。本研究中，DHP的橙皮苷含量最高，而川陈皮素和橘皮素在NFMJ中最为丰富。尽管GCP传统上被认为品质最佳，但其橙皮苷、川陈皮素和橘皮素的含量显著低于其他品种，且9种化合物的总含量最低。这可能与GCP独特的陈化工艺有关，中医理论认为陈化可减轻其“燥性”，现代研究也表明陈化过程会导致化学成分变化。
一个关键发现是，橙皮素仅在GCP样品中被定量检测，平均浓度为0.029 mg/g，而在其他六个品种中其含量低于定量限。LC-MS/MS数据也证实了这一点。鉴于其在GCP中的特异性富集，橙皮素有望作为区分GCP的潜在特征性标志物。橙皮素已知是橙皮苷在陈化过程中的降解产物，其含量随陈化时间延长而增加，而橙皮苷含量下降。因此，橙皮苷/橙皮素的比值未来或可作为评估GCP陈化年限的潜在指标。
多元统计分析
PCA与OPLS-DA分析：基于9种黄酮含量的PCA分析显示，累计R2X和Q2值分别为0.969和0.753，模型性能良好。PCA得分图（图4A）表明，BDZ、NFMJ、DHP、JG、GCP和WZMG能够被清晰区分，无重叠。虽然PG与NFMJ和DHP存在部分重叠，但其样品自身聚集紧密。进一步对PG、NFMJ和DHP进行单独的PCA分析，结果显示三者各自形成独立的簇（图4B）。为了更精确地区分这三者，构建了三组独立的OPLS-DA模型（图5A-C）。所有模型的R2Y和Q2值均超过0.967和0.895，且200次置换验证表明模型均未过拟合（图5D-F），证实了这三种品种间尽管化学轮廓相似，但仍存在显著差异。
层次聚类分析（HCA）：HCA结果（图6）与PCA和OPLS-DA的发现高度一致。7个品种被分为两个主要分支：一个分支包含GCP、BDZ、JG和WZMG，其中GCP和BDZ先聚为一类，JG和WZMG再与之聚合；另一个分支包含NFMJ、DHP和PG，其中NFMJ和DHP的亲缘关系更近，PG则与之稍远。这进一步从整体化学相似性的角度验证了各品种间的分类关系。
结论
本研究通过LC-MS/MS非靶向分析结合UPLC靶向定量，成功地对7个市售常见陈皮栽培品种进行了化学表征和区分。建立并验证了一种同时定量9种黄酮类化合物的UPLC方法，该方法快速、准确、可靠。多元统计分析（PCA、OPLS-DA、HCA）证实，所研究的7个陈皮品种具有明显不同的黄酮类化学成分谱。其中，橙皮素被确定为GCP潜在的特异性标志物。尽管各品种整体化学轮廓相似，但其黄酮含量存在显著差异。将UPLC定量与多元统计分析相结合的策略，为区分主要陈皮栽培品种、实现有效的质量控制以及未来的深入研究（如陈化机制、品质评价体系构建）提供了新的见解和实用方法。
