《Food Science & Nutrition》：Pigmented Sorghum Phenolic Extracts Regulate the Expression of Cancer Development Pathway Genes in HT-29 and Hypoxia-Induced CCD 841 CoN Cells
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本研究首次系统揭示了黑、红等有色高粱（Sorghum bicolor L. Moench）的原始（RSE）与发酵-蒸煮处理（PSE）多酚提取物，在结直肠癌HT-29细胞和缺氧诱导的正常CCD 841 CoN结肠细胞中，调控癌症发展核心通路基因表达的潜在化学预防作用。研究表明，这些提取物可显著下调癌细胞活力，上调抑癌基因（如APC）、促凋亡基因（如TTN）表达，并抑制缺氧诱导因子（HIF-1α/β）和葡萄糖转运蛋白-1（GLUT-1）的表达，为高粱多酚作为功能食品成分在肿瘤防治中的应用提供了重要的实验依据。
1 引言
癌症是一种异质性疾病，与不良饮食习惯密切相关。全谷物高粱是一种公认的酚类化合物丰富来源，尤其在其有色品种中含有花青素和原花青素等活性成分，这些化合物具有抗氧化、抗增殖等生物活性，可调节癌症发展通路。基因组突变与不稳定性是癌症发展的十大通路之一，与细胞凋亡密切相关。肿瘤抑制基因APC是调控Wnt/β-联蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路的关键。癌细胞常通过抑制APC和下调KRAS、TTN等促凋亡蛋白来逃避凋亡。代谢重编程（又称失调的细胞代谢）使癌细胞能够通过上调葡萄糖转运蛋白（特别是GLUT-1）来满足快速分裂的能量需求。从有氧糖酵解向无氧糖酵解的代谢转换由HIF-1癌基因（HIF-1α和HIF-1β）协调。了解营养、糖酵解和高粱酚类化合物可能引起的细胞代谢变化之间的相互作用至关重要。本研究旨在探索有色高粱全谷物酚类提取物在结直肠癌细胞和缺氧诱导的正常结肠细胞中诱导程序性细胞死亡和调节细胞代谢的促凋亡基因及其机制，并确定加工处理对上述癌症发展通路的影响。
2）并促进缺氧诱导因子1α（HIF-1α）癌基因的降解。相比之下，缺氧条件下的癌细胞依赖无氧糖酵解，其中HIF-1α募集HIF-1β形成复合物，结合到缺氧反应元件（HREs），驱动支持肿瘤生长和存活的基因转录——这一过程称为Warburg效应。高粱多酚被提出可抑制HIF-1α，破坏此通路并促进代谢转换回有氧糖酵解。">
2 材料与方法
2.1 高粱样品收集
白（WhiteLi1、WhiteLi2）、红（RedBa1、RedBu1、RedBa2、RedBu2）和黑（BlackSb、BlackSs）高粱全谷物样品按之前描述的方式获取。黑色样品来源于2021年在昆士兰州沃里克进行的温室试验，红色和白色样品来源于2021年在新南威尔士州贝拉塔和克罗帕溪进行的田间试验。实验前，样品储存于4°C。每个样品在每次实验中设三个重复。
2.2 高粱提取物的加工与制备
使用配备0.5毫米筛网的Retsch超离心研磨机将全谷物精细研磨成高粱粉。用己烷（1:20 w/v）对样品进行三次脱脂处理，然后在通风橱中蒸发24小时以获得脱脂面粉。脱脂高粱面粉在加工前储存于4°C。发酵-蒸煮处理参照先前方法进行：将高粱粉与去离子水以1:2的比例混合，在25°C下发酵直至pH达到4（约48小时）。将此混合物加入80毫升沸水中搅拌10分钟，然后转移至水浴停止蒸煮过程。发酵-蒸煮的高粱粥样品在-80°C冷冻，然后冻干并研磨以获得发酵-蒸煮（加工）面粉。提取物制备：使用70%丙酮、29.5%水和0.5%乙酸（v/v/v）的混合溶剂，以1:10（w/v）的比例添加到脱脂的原始或加工面粉中，在25°C下搅拌1小时。混合物在4000 rpm下离心10分钟；重复提取两次，合并上清液。在50°C下使用旋转真空蒸发器去除丙酮。剩余液体在-80°C冷冻并冻干。所得酚类提取物储存于-20°C直至分析。使用50%甲醇溶液重构提取物。
2.3 试剂与化学品
细胞培养材料包括二甲基亚砜（DMSO）、杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）、伊格尔最低必需培养基（EMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、胰蛋白酶、过氧化氢（H2O2）、刃天青红染料等。HT-29结直肠癌细胞和正常CCD 841 CoN结肠细胞购自ATCC分销商。使用Bio-Rad的Aurum总RNA提取试剂盒、iScript cDNA合成试剂盒、SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix试剂盒以及人APC、KRAS、TTN、HIF-1α、HIF-1β（ARNT）、GLUT-1（SLC2A1）和内参基因β-肌动蛋白（β-Actin）的PrimePCR SYBR Green引物。人APC和TTN ELISA试剂盒购自Sapphire Biosciences。
2.4 细胞培养处理
HT-29结直肠癌细胞系在含有89%（v/v）DMEM、10%（v/v）FBS和1%（v/v）青霉素-链霉素的培养基中单层培养和维持。正常结肠细胞系CCD 841 CoN在添加了相同体积比的FBS和青霉素-链霉素的EMEM中生长。为获得最佳生长，正常结肠细胞使用第5至9代，在70%–80%融合度时进行实验。细胞在37°C、5% CO2的加湿培养箱中维持培养。
2.5 刃天红细胞毒性试验
为了测试高粱提取物的细胞毒性，进行了时间和剂量反应的细胞毒性试验。将提取物用细胞培养基稀释至50、100、250、500、1000、1500和2000 μg/mL的浓度。将HT-29细胞以每孔5 × 103个细胞的密度接种于96孔板。孵育24小时后，用PBS清洗细胞，然后与不同提取物一起孵育。另设一个不含细胞的提取物板以补偿提取物颜色，用于空白校正数据。阳性对照为10 mM过氧化氢，阴性对照为新鲜培养基，并包括2% DMSO对照（重构提取物中的最大浓度）。高粱提取物的细胞毒性也在CCD 841 CoN正常结肠细胞上进行了测试。处理4、6、12和24小时后，移除提取物，用PBS清洗孔，然后每孔加入200 μL 14 mg/L的刃天红染料，再孵育4小时。测量570和600 nm处的吸光度，并根据既定公式计算细胞存活率。
2.6 实验设计与低氧诱导
为了确定高粱提取物对代谢基因的影响，使用实时荧光定量PCR（rtPCR）测定HIF-1α、HIF-1β和GLUT-1的基因表达。低氧条件通过氯化钴（II）六水合物（CoCl2•6H2O）在正常CCD 841 CoN结肠细胞上诱导。制备25 mM的CoCl2储备液，在EMEM培养基中获得100 μM的最终浓度。还设置了常氧（无CoCl2的细胞）阴性和低氧（无提取物的低氧诱导细胞）阳性对照。将细胞以2 × 105的密度接种于24孔板，在37°C、5% CO2下孵育24小时。当细胞达到90%融合度时，将CoCl2工作液加入正常结肠细胞中24小时，然后补充不同浓度的高粱提取物。孵育后，移除提取物，用PBS清洗细胞，然后裂解用于后续rtPCR分析。
2.7 RNA和cDNA提取
使用Bio-Rad Aurum总RNA提取试剂盒提取总RNA。取2 μL RNA样品加入NanoDrop 2000c分光光度计评估RNA纯度。使用iScript cDNA合成试剂盒和CFX96实时系统合成cDNA。反应在Hard-Shell 96孔PCR板中进行，包括4 μL 5× iScript反应混合物、1 μL iScript逆转录酶、10 μL无核酸酶水和5 μL RNA模板（每孔总体积20 μL）。热反应程序包括：25°C引物结合5分钟，46°C逆转录20分钟，95°C逆转录失活1分钟，然后保持在4°C。反应产物在rtPCR分析前储存于-20°C。
2.8 实时荧光定量PCR（rtPCR）分析
使用SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix在CFX96实时系统上进行实时荧光定量PCR。所用引物如前所述，用Tris-EDTA（TE）缓冲液按1:10（v/v）稀释。反应在Hard-Shell 96孔PCR板中进行，包括10 μL SSoAdvanced Universal SYBR Green Supermix、2 μL引物、2 μL cDNA模板（用TE缓冲液1:20 v/v稀释）和6 μL无核酸酶水（每孔总体积20 μL）。热反应程序包括：95°C变性3分钟，随后在95°C 15秒和60°C 30秒的条件下进行40个循环的扩增。从65°C到95°C进行熔解曲线分析。每个基因用内参基因β-肌动蛋白（?-actin）进行归一化，以计算相对丰度。
2.9 酶联免疫吸附测定（ELISA）
为了量化细胞内蛋白浓度，由于其在rtPCR中的基因表达水平，选用了人APC和TTN ELISA试剂盒。简言之，将HT-29细胞接种于24孔板，然后用原始和加工的BlackSs、BlackSb和RedBu2高粱提取物在500和2000 μg/mL的浓度下处理12和24小时。处理后，移除提取物，用PBS清洗细胞并用裂解缓冲液裂解。将细胞裂解物加入预先包被了APC或TTN抗体的96孔微孔板中，随后根据制造商的说明在37°C孵育2小时。加入检测抗体、链霉亲和素-HRP并用PBS多次洗板后，通过加入终止溶液停止反应，使用酶标仪在450 nm处测量吸光度。通过向每个抗体板添加七个稀释度来绘制标准曲线，以确定蛋白浓度。
2.10 数据分析
数据以平均值±标准差表示。所有数据均使用GraphPad Prism软件（10版）进行分析，采用普通单因素方差分析（ANOVA）结合Tukey多重比较事后检验，随后进行双因素方差分析（ANOVA）和未校正的Fisher's LSD检验。差异显著性水平设定为p < 0.05。
3 结果
3.1 细胞毒性试验
刃天红试验用于确定八种高粱提取物对HT-29结肠癌细胞的影响。细胞与高粱酚类提取物（50、100、250、500、1000、1500、2000 μg/mL）孵育4、6、12和24小时。结果表明，原始黑色和红色高粱品种在500和2000 μg/mL浓度下，在12和24小时后显示出癌细胞活力的显著（p < 0.05）下降，而白色和红色高粱品种的原始样品未显示癌细胞活力下降。然而，红色高粱品种RedBu2在经过发酵-蒸煮加工后，在24小时显示出细胞活力的显著降低。黑色高粱品种BlackSs和BlackSb的原始样品在500 μg/mL时最初显示出细胞生长抑制，而相同品种的加工样品则在2000 μg/mL时显示出细胞生长抑制。基于红色和黑色高粱提取物将细胞活力降低50%的细胞毒性效应，选择了500和2000 μg/mL浓度、12和24小时的处理条件用于后续实验。CCD 841 CoN正常结肠细胞系在上述处理条件下未表现出细胞毒性。
3.2 原始与加工高粱提取物对基因组突变与不稳定性癌症发展通路基因表达的影响
使用定量实时荧光定量PCR阐明了原始BlackSs和BlackSb对HT-29结肠癌细胞中APC、KRAS和TTN基因表达的影响。结果显示，各处理组间的基因表达均有显著增加（p < 0.05），但幅度不同。用500 μg/mL BlackSs处理12小时，导致APC基因表达上调80%，在24小时时进一步增加了两倍。KRAS基因仅在最高浓度2000 μg/mL处理24小时后显示出显著的八倍上调，表明黑色高粱提取物以时间依赖性方式影响癌细胞生长。TTN基因表达在2000 μg/mL处理后显著增加，表明上调可能以剂量依赖性方式发生。用500 μg/mL BlackSb补充也导致APC基因在12小时时上调2倍，但在24小时时基因表达无显著变化。值得注意的是，BlackSb也上调了KRAS和TTN基因，但表达水平较低。
由于研究结果还表明，用加工后的BlackSs、BlackSb和RedBu2高粱提取物处理24小时后癌细胞活力降低，本研究进一步使用rtPCR研究了APC、KRAS和TTN的基因表达。补充500 μg/mL加工后的BlackSs与对照相比，APC基因表达显著（p < 0.05）上调2倍。值得注意的是，KRAS基因在500 μg/mL时显著上调，在较高浓度时趋于稳定。加工后的BlackSs处理未改变TTN的表达。BlackSb在APC和TTN上显示出相似的基因表达水平，尽管KRAS基因显示出剂量依赖性的增加。有趣的是，加工后的红色高粱RedBu2是所研究的样品中唯一显示TTN基因表达增加的样品。该样品的APC或KRAS基因表达未检测到变化。
3.3 原始黑色高粱提取物对低氧诱导的细胞代谢癌症发展通路基因表达的影响
在CCD 841 CoN正常结肠细胞中诱导低氧，以确定高粱提取物对HIF-1癌基因和葡萄糖转运蛋白基因的影响，并与常氧条件比较。用2000 μg/mL BlackSs处理细胞12小时，导致HIF-1α基因表达显著下调至常氧水平。同一基因在500 μg/mL处理24小时时观察到表达水平，在较高浓度时进一步降低3倍，显示出剂量和时间依赖性活性。用2000 μg/mL BlackSs处理低氧诱导的结肠细胞显示HIF-1β降低3倍，但在其他处理条件下无显著变化。有趣的是，GLUT-1表现出最大的表达水平差异，在所有处理条件下均显示出与低氧水平相比表达显著降低。BlackSs中HIF-1α的基因表达水平与BlackSb中观察到的结果相当，在BlackSb中，HIF-1α表达也降低至常氧水平。BlackSb补充后，在500 μg/mL处理12小时时检测到HIF-1β显著上调，其他处理条件下无显著变化。与BlackSs类似，GLUT-1基因表达水平降低，但这仅在2000 μg/mL时以剂量依赖性方式观察到。加工后的高粱样品RedBu2、BlackSs和BlackSb未显示出HIF-1α、HIF-1β和GLUT-1基因表达水平的变化。
3.4 原始与加工高粱提取物对基因组突变与不稳定性通路基因蛋白表达的影响
使用ELISA进一步研究了原始和加工的BlackSs、BlackSb和RedBu2提取物对突变基因癌症发展通路蛋白表达的影响。APC和TTN的蛋白表达结果与rtPCR基因表达结果非常相似。由于其在12和24小时均有较高的表达水平，选择了三个基因中的两个（APC和TTN）用于后续蛋白表达分析。在500 μg/mL时，原始BlackSs在12小时时以时间依赖性方式使APC蛋白表达水平显著增加2倍，在24小时时进一步增加两倍。定量分析显示，用2000 μg/mL处理细胞12和24小时后，APC蛋白水平未显示统计学上的显著变化。相反，补充500 μg/mL原始BlackSb仅在12小时时显示出APC蛋白表达水平显著增加4倍，表明其对蛋白表达的影响具有时间和剂量依赖性。加工后的RedBu2、BlackSs和BlackSb样品对APC蛋白表达水平无显著影响。
用2000 μg/mL原始BlackSs处理HT-29细胞，在24小时时以时间和剂量依赖性方式使TTN蛋白表达水平显著增加4倍。此外，在500 μg/mL处理12和24小时以及在2000 μg/mL处理12小时时，TTN蛋白表达水平也显示出轻微但显著的增加。用2000 μg/mL原始BlackSb处理细胞在24小时时显示出TTN蛋白表达水平显著增加2倍；然而，与BlackSs相比，这种增加幅度较小。BlackSb的其他处理条件显示出TTN蛋白表达水平轻微但显著的增加。出乎意料的是，加工后的RedBu2的TTN表达水平高于BlackSs和BlackSb。在24小时时，该样品在500 μg/mL时使TTN表达显著增加2倍，在2000 μg/mL时增加3倍。加工后的BlackSs在500 μg/mL时显示出TTN表达的轻微但显著增加；然而，在较高浓度时表达水平趋于稳定。BlackSb观察到类似结果，但2000 μg/mL时的稳定状态不显著。
2）补充HT-29结肠癌细胞后，通过ELISA测定的TTN蛋白浓度水平。">
4 讨论
在本研究中，使用HT-29结肠癌细胞和低氧诱导的CCD 841 CoN正常结肠细胞，研究了原始和加工的黑色及红色高粱提取物（BlackSs、BlackSb和RedBu2）的抗癌特性。这些有色高粱谷物提取物在先前的调查中被证明，在发酵-蒸煮过程后，由于总酚和抗氧化剂水平升高，酚类物质的可及性和检测量增加。此外，据报道，几种生物可利用的高粱多酚能够通过细胞生物转化过程到达结肠，从而产生相关的健康益处。本研究的结果首次证明，BlackSs、BlackSb和RedBu2在500或2000 μg/mL浓度下显著降低了结肠癌细胞活力。这可能是由于原始和加工的黑色高粱提取物以剂量和时间依赖性方式显著增加了促凋亡基因的基因表达水平及其相应的蛋白浓度。此外，BlackSs和BlackSb提取物还在不同处理水平上下调了低氧诱导的CCD 841 CoN正常结肠细胞中过表达的代谢基因，从而表现出抗癌代谢活性。
癌细胞存活依赖于抗凋亡的基因组修饰。例如，由于“基因组守护者”——p53的基因突变，BCL-2基因家族在癌细胞中通常过表达。肿瘤抑制基因APC也被报道为结肠癌细胞中突变频率高达80%的常见突变基因。原始黑色高粱提取物，特别是BlackSs，在mRNA和蛋白水平上均上调了该基因，为其在促进凋亡中的作用提供了证据。其作用机制可能是通过调节Wnt/β-联蛋白（Wnt/β-catenin）信号通路：高粱多酚可以促进APC与Axin的结合，并促进β-联蛋白的磷酸化。有趣的是，加工后的黑色高粱提取物也显示出APC基因表达的显著增加；然而，当用ELISA测量时，未检测到该蛋白。这种差异可能是由于转录后变异或抑制蛋白质产物翻译和稳定性的细胞内机制所致。有研究报道，开花植物Peucedanum chenur的氯仿提取物在120 μg/mL的半最大抑制浓度下，上调了HCT-116结直肠癌细胞中的APC基因。与本研究类似，这表明了以剂量依赖性方式抑制Wnt/β-联蛋白信号通路。此外，红茶多酚茶黄素和茶红素已被证明通过抑制Akt和Wnt/β-联蛋白信号通路来降低U937和K562白血病细胞的活力。
KRAS和TTN基因主要参与细胞信号传导和生长激活，据报道突变频率分别为50%和40%。研究结果表明，两种基因的基因表达均增加，BlackSs在2000 μg/mL的补充浓度下显示出比BlackSb更大的上调。BlackSs在原始样品中显示出比BlackSb更高的KRAS基因表达水平；然而，加工后的样品显示出相反的趋势。这一发现表明，原始BlackSs和加工后的BlackSb可能激活MAPK/ERK和PI3K/Akt信号通路。与BlackSs相比，BlackSb诱导了TTN基因表达的轻微但显著增加，但在较高浓度时趋于稳定。这种稳定表明，低氧诱导的CCD 841 CoN细胞可能已达到BlackSb的TTN蛋白合成最大容量，或者可能激活了反馈机制来调节进一步表达，从而降低TTN转录效率。据我们所知，本研究是首次报道加工后高粱对TTN基因的生物活性。值得注意的是，加工后的RedBu2在TTN方面表现出优于BlackSs和BlackSb的基因表达水平。这种差异可能归因于酚类成分的差异或加工后可能影响基因表达和浓度水平的调节因子。在之前的研究中，我们证明了RedBu2在经过发酵-蒸煮加工后，抗氧化活性增加了25%。该样品含有多种升高的抗氧化化合物，如4-乙酰丁酸、咖啡酸、反式云杉新苷和反式白藜芦醇苷，这些可能促成了本研究中TTN的上调。这些化合物以及其他化合物已被证明在细胞结构稳定性的下游调节信号通路中发挥重要作用，从而对TTN蛋白产生影响。
失调的葡萄糖代谢作为一种癌症发展通路，是由快速增殖细胞为满足高能量需求而偏好无氧糖酵解而非氧化磷酸化所驱动的。这种代谢转换主要由HIF-1癌基因（HIF-1α和HIF-1?）调节，它们与低氧反应元件结合并诱导癌性DNA转录。在当前研究中，我们报告BlackSs和BlackSb高粱提取物可以通过抑制低氧诱导的CCD 841 CoN正常结肠细胞中的HIF-1α基因来潜在地重建正常细胞代谢。其作用机制可能是由于酚类A环和B环结构活性相互作用使核转位的HIF-1α失活。Ansó等人的一项类似研究表明，黄酮类芹菜素、木犀草素和槲皮素（均在我们的高粱样品中发现）通过抑制PI3K/Akt通路中的Akt磷酸化来降低HIF-1α表达。然而，尚无近期研究探索这些发现。HIF-1?的表达被认为在低
