《Food Science & Nutrition》：Comparative Study of Microwave and Ultrasound-Assisted Extraction of Phosvitin From Egg Yolk
引言
蛋白因其天然来源、无毒性、价格适中及功能多样性（包括乳化、发泡、凝胶和抗氧化活性）而被广泛应用于食品体系中。鸡蛋是全球饮食的重要组成部分，尽管含水量高，却是优质蛋白质以及不饱和脂肪酸、铁、磷、微量元素和维生素A、E、K和B的重要来源。然而，对低脂、高蛋白蛋清需求的增加导致了蛋黄供应过剩，限制了蛋业的经济发展潜力。通过基于功能和营养特性的蛋白质分离和纯化来开发新产品，可以提升蛋黄的价值和利用率。
蛋黄由两部分组成：血浆（78%）和颗粒（22%）。血浆由低密度脂蛋白（LDL，85%）和球状糖蛋白（15%）组成。颗粒则由高密度脂蛋白（HDL，73%）、低密度脂蛋白（LDL，9%）和卵黄高磷蛋白（Phosvitin，18%）构成。卵黄高磷蛋白约占蛋黄蛋白的11%，是蛋黄的主要磷蛋白，其氨基酸的50%–57%为丝氨酸，其中90%被磷酸化。卵黄高磷蛋白具有两亲性结构，中间为亲水部分，末端为疏水部分。其高磷酸化水平赋予了其热稳定性、金属结合、抗氧化活性和乳化特性等多种生理活性，使其成为一种有前景的功能性化合物。作为一种增值蛋白，卵黄高磷蛋白在抗炎、抗菌、抗氧化和改善肠道健康方面具有潜在应用。
为了获得高纯度的卵黄高磷蛋白，必须去除LDL和HDL。LDL可以通过蛋黄稀释后离心轻松分离，但卵黄高磷蛋白与HDL之间存在的磷酸钙桥使分离变得复杂。这个桥是在残留的磷酸丝氨酸卵黄高磷蛋白的磷酸基团与钙离子形成的不溶性颗粒之间形成的。虽然色谱法可用于制备高纯度卵黄高磷蛋白，但该技术因通量低和成本高而在实际生产中受限。目前已采用多种方法来提取高纯度卵黄高磷蛋白，但许多方法存在残留有机溶剂、操作复杂、耗时、产率低、结构改变和功能特性降低等缺点。因此，需要新的提取方法来生产高纯度卵黄高磷蛋白。目前提高蛋白质提取效率的方法包括超声、微波、酶法、脉冲电场和超临界流体提取。这些环保方法具有省时、提取效率高、无有机溶剂残留和节能等优势。
微波对蛋白质具有多样且有益的影响，包括亲水性和疏水性变化、结构展开、消化率、变性、乳化、发泡、凝胶强度、氧化和脱敏，具体效果取决于功率、应用时间、蛋白质性质和食品类型。与传统加热相比，微波可以加速蛋白质的展开。高功率微波加热可破坏二硫键，将疏水核心暴露于溶剂并使蛋白质解聚，从而提高产量和纯度。微波削弱了分子内和分子间作用力，包括氢键、二硫键和疏水相互作用，通过重新排列分子力形成新结构。然而，也有研究者认为微波辐照不会显著改变蛋白质的二级结构，主要影响三级结构。
超声提取通过空化作用加速传质并释放蛋白质。超声辅助提取的高提取效率主要归功于其机械效应，如微射流和微电流。先前的研究报告称，与传统工艺相比，超声处理可获得更高的蛋白质回收率，从而产生更高的产率以及增加的溶解度和蛋白质回收率。
尽管卵黄高磷蛋白作为一种具有宝贵功能和营养特性的蛋白质具有重要意义，但关于使用超声和微波等现代技术从蛋黄中提取该化合物的研究有限。本研究旨在开发一种创新、安全、无毒的卵黄高磷蛋白无溶剂提取方法，从而保持质量和效率，并使该化合物能够在食品工业中得到更广泛的应用。本研究的创新之处在于使用绿色和非传统技术回收卵黄高磷蛋白，这可以为蛋黄酱和烘焙食品等产品提供一种健康且无胆固醇的替代品。在这方面，本研究首次全面研究和比较了超声和微波方法提取的卵黄高磷蛋白的提取效率、纯度、抗氧化活性、乳化能力和乳液稳定性。
材料与方法
2.1 原材料
新鲜鸡蛋购自Clay John公司（伊朗卡尔德科伊），透析袋（D9527：14kd：43毫米）购自Sigma-Aldrich，其他化学品购自Merck。透析袋和化学品在伊朗的供应商是Tamad Kala公司（伊朗德黑兰）。所有化学品均为分析纯，纯度99%。提取使用探头式超声设备（Topsonics型号400W-20KHz，英国）和微波设备（型号MA3882RC，韩国）。
2.2 卵黄高磷蛋白的提取
首先，将蛋清与蛋黄分离。接下来，用等比例的纯水稀释蛋黄（1：1比例）。在冰水中搅拌30分钟后，将稀释的蛋黄溶液在5488g下离心50分钟以获得沉淀物（温度8°C）。然后，将沉淀物与其重量4倍的10%（w/w）硫酸铵溶液（混合物的pH=5.5-增加卵黄高磷蛋白的溶解度）混合，并在混合水/冰浴中在0°C下搅拌3小时（不溶性蛋白质絮凝）。然后，将混合物在80°C的水浴中搅拌15分钟（以使卵黄脂磷蛋白（HDL）变性）。分别应用不同功率（200、300和400W）的超声探头（频率20kHz）和不同功率（180、360和600W）的微波，单独处理4分钟和8分钟。样品温度低于40°C，通过将温度计插入样品中检查。超声以脉冲方式施加（10秒脉冲和3秒休息）。为了将温度保持在40°C以下，微波辐射施加30秒，然后休息30秒。此外，在休息期间，将样品容器放置在装有冷水的容器中，直到样品温度达到25°C。随后，在蒸馏水（温度25°C）中进行5步透析（每步4小时）。每次透析后，更换蒸馏水。透析过程中不搅拌蒸馏水。然后，将获得的混合物在5488g下离心20分钟（温度8°C）。最后通过分离和冷冻干燥制备卵黄高磷蛋白粉末。
2.3 提取产率%的测定
计算从100克干蛋黄中获得的提取物干重。
2.4 磷%和卵黄高磷蛋白%的测定
采用Murphy-Riley的磷测定法进行此测定。灰化过程后，根据抗坏血酸存在下磷钼酸盐复合物还原形成的颜色测定磷含量。卵黄高磷蛋白的量通过磷含量乘以10获得。
2.5 氮%和总蛋白质%的测定
使用凯氏定氮法测定提取的卵黄高磷蛋白样品中的总氮，采用氮系数。卵黄高磷蛋白的氮系数为7.69。将卵黄高磷蛋白的量除以系数7.69，得到卵黄高磷蛋白氮的量。然后，从总氮中减去卵黄高磷蛋白氮。剩余氮乘以5.72（蛋黄蛋白转换因子）得到非卵黄高磷蛋白蛋白的量。最后，总蛋白由卵黄高磷蛋白蛋白和非卵黄高磷蛋白蛋白的总和获得。
2.6 卵黄高磷蛋白与总蛋白的比率（%卵黄高磷蛋白纯度）
通过将卵黄高磷蛋白%除以总蛋白获得卵黄高磷蛋白的纯度。
2.7 卵黄高磷蛋白回收率
卵黄高磷蛋白含有约10%的磷，样品中卵黄高磷蛋白的百分比通过磷百分比乘以10获得。然后，将卵黄高磷蛋白百分比乘以产率。假设100克干蛋黄含有4克卵黄高磷蛋白，计算回收率。
2.8 FT-IR（傅里叶变换红外光谱）
将0.1克卵黄高磷蛋白置于直径1厘米的圆盘上以测量和鉴定蛋白质组成。卵黄高磷蛋白组成的测量在650至4000cm-1范围内进行。
2.9 SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）
使用10%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，凝胶用30%丙烯酰胺溶液、1.5M Tris–HCl（pH 8.8）、0.5M Tris–HCl（pH 6.8）、10%过硫酸铵和TEMED制备。凝胶中的蛋白质用考马斯亮蓝染色，考马斯亮蓝含有0.1M硝酸铝，随后在10%乙酸溶液中染色。然后进行成像。根据条带强度相对于分子量估计蛋白质溶液中卵黄高磷蛋白的相对组成。
在此步骤中，首先从两种提取方法中各选择卵黄高磷蛋白纯度最高的样品。然后，对它们进行DPPH自由基清除测试、ESI和EAI以进行比较。
2.10 DPPH测定
评估MT8P600和UT8P400样品抑制DPPH自由基的能力。将0.1 mL MT8P600和UT8P400样品（每种在水中的浓度为1 mg/mL）与10 mL DPPH甲醇溶液（浓度为0.004%）混合。在室温（25°C）黑暗条件下孵育1小时后，在517 nm处测量样品的吸光度。使用公式计算MT8P600和UT8P400样品的DPPH自由基抑制能力。
2.11 乳化活性指数（EAI）和乳液稳定性指数（ESI）
评估EAI和ESI。将2 mL葵花籽油与18 mL浓度为10 mg/mL的卵黄高磷蛋白溶液（UT8P400和MT8P600）混合。将混合物在6000g下均质6分钟。从卵黄高磷蛋白制备的乳液中取出10微升，加入到8 mL 0.1%（w/w）SDS溶液中。记录混合物在500 nm处的吸光度，以0.1% SDS溶液为空白。基于公式计算EAI。30分钟后，记录UT8P400和MT8P600乳状液在λ=500 nm处的吸光度。使用公式计算UT8P400和MT8P600样品的ESI。
2.12 统计分析
本研究中的所有统计方法均使用SPSS版本21软件进行单因素方差分析，并使用邓肯检验显示置信水平高于95%的最小显著性差异。结果以平均值和标准差的形式显示，为减少误差，所有实验均重复三次。使用Excel 2013版软件绘制图表。
结果与讨论
3.1 提取产率%
结果表明，在不同功率和时间条件下，使用超声提取卵黄高磷蛋白的产率存在显著差异。因为超声功率与空化强度相关，功率越高，空化越强，导致蛋白质聚集和沉淀。对于微波辅助提取，在两种时间（4分钟和8分钟）下，卵黄高磷蛋白产率随功率增加而降低。在不同功率水平（180、360和600W）下，产率随着提取时间的延长而降低。最高和最低产率分别在微波功率为180W处理4分钟（MT4P180，4.68%）和MT8P600（3.20%）的样品中发现。研究人员指出，180W的微波功率导致最高的蛋白质产率。相反，在更高功率（240W）下，更长的提取时间会导致产率下降，这与当前研究的发现一致。有研究报告了使用加热提取卵黄高磷蛋白的产率为2.35%，表明超声和微波方法有效地提高了卵黄高磷蛋白的产率。
3.2 磷%的测定
结果表明，在4分钟和8分钟内，磷百分比随着超声功率的增加而增加。在所有功率水平下，磷含量随着超声持续时间的延长而增加。样品UT8P400（4.20%）的磷百分比最高，而超声功率为200W处理8分钟（UT8P200，3.78%）的样品在提取的卵黄高磷蛋白样品中最低。功率和超声时间的增加增强了空化强度和空化口袋的数量，导致更高的磷提取。类似地，增加微波功率和时间增加了样品中的磷水平。在4分钟内，磷百分比随着微波功率的增加而增加。样品微波功率180W处理8分钟（MT8P180）和MT4P180分别在提取的卵黄高磷蛋白样品中具有最高（5.77%）和最低（5.11%）的磷百分比。有研究报告了使用液相色谱和凝胶过滤色谱法测得的磷含量分别为39.5和28.73毫克，这与本研究的结果一致。
3.3 氮%和总蛋白质%
样品的氮含量反映了提取样品中的蛋白质百分比，其中卵黄高磷蛋白是主要蛋白质。结果表明，在8分钟内，氮百分比随着功率的增加而增加。最高和最低的蛋白质百分比分别在UT8P400（77.18%）和UT8P200（70.97%）中观察到。超声功率300W处理4分钟（UT4P300）和超声功率300W处理8分钟（UT8P300）样品在氮百分比上没有显著差异。然而，这并不适用于蛋白质的量。由于主要蛋白质的类型及其氮含量。如表所示，UT8P300样品的磷含量高于UT4P300样品，表明卵黄高磷蛋白含量更高，这影响了蛋白质百分比。这是因为卵黄高磷蛋白的转换因子（7.69）与蛋黄蛋白的转换因子（5.72）不同。由于卵黄高磷蛋白的80%由氨基酸丝氨酸组成，这直接影响蛋白质转换因子。结果还显示，增加微波功率处理8分钟导致氮含量上升。蛋白质含量最高和最低的样品分别是MT8P600和MT8P180，这与之前的研究结果一致。研究人员发现，增加时间和温度会导致更高的蛋白质提取。其他研究也报告称，增加超声时间和微波功率到350W增强了蛋白质提取。
3.4 卵黄高磷蛋白回收率
卵黄高磷蛋白回收率是从蛋黄总卵黄高磷蛋白中获得的卵黄高磷蛋白百分比。结果显示，最低和最高的蛋白质百分比分别是UT8P400（31.39%）和UT4P200（35.81%）。结果显示，与卵黄高磷蛋白纯度不同，随着微波功率和时间的增加，回收率下降。最低和最高的回收率分别在样品（MT8P600）（45.44%）和（MT8P180）（59.78%）中。有研究报告了卵黄高磷蛋白的回收率在15%到62.5%之间。他们解释说，卵黄高磷蛋白的提取受pH值和盐的影响。另一项研究报告了通过液相色谱提取和纯化卵黄高磷蛋白的回收率为30%至32%，这与超声提取卵黄高磷蛋白的结果一致，但低于微波提取卵黄高磷蛋白。
3.5 卵黄高磷蛋白与总蛋白的比率（%卵黄高磷蛋白纯度）
卵黄高磷蛋白与总蛋白的比率表明了卵黄高磷蛋白的纯度。最高值在使用超声提取的样品UT8P400（54.41%）和使用微波提取的样品MT8P600（76.68%）中观察到。结果表明，增加提取过程中的功率和时间导致更高的卵黄高磷蛋白纯度，因为这些条件促进了HDL的分离和沉淀。有研究发现，增加微波时间和功率导致从蛋清中获得的卵清类粘蛋白具有更高的纯度（95%），突出了微波对蛋白质提取和纯度的积极影响。研究人员还指出，与未经预处理的提取相比，微波和超声提取方法提高了从皮肤和骨骼中提取的胶原蛋白的纯度。在一项关于使用液相色谱和凝胶过滤色谱提取卵黄高磷蛋白的研究中，报告的卵黄高磷蛋白与总蛋白比率分别为74%和81%，这与当前研究的结果一致并加以证实。研究人员观察到，施加高压和增加处理时间导致卵黄高磷蛋白的纯度从27%增加到40%。与当前研究相比，他们的纯度百分比更低，这表明在卵黄高磷蛋白提取过程中，超声和微波工艺优于高压工艺。
3.6 FT-IR测定
图1展示了卵黄高磷蛋白UE样品的FT-IR光谱，不同样品的峰叠加在一起。这表明在较短时间（4分钟和8分钟）和较低功率（200、300和400W）下的超声处理纯化能力有限，HDL去除极少，这与之前的研究一致。图2展示了卵黄高磷蛋白ME样品的FT-IR光谱。在976和1079处的峰分别对应于PO43-的对称和不对称伸缩振动。此外，在1600–1700和1500–1600处的酰胺I和II带表明卵黄高磷蛋白是一种高度磷酸化的蛋白质。在3301和3404之间的带宽与卵黄高磷蛋白蛋白的N-H伸缩振动有关。1660和1530附近的峰表示酰胺I中的C=O伸缩以及酰胺II中的N–H弯曲和C–N伸缩。超声提取样品中HDL的存在导致在1600–1800峰范围内（代表C=O官能团）的透射率百分比更高。另一方面，3200–3400处的峰（代表O–H官能团）在HDL存在时透射率百分比较低。在提及的峰中透射率百分比的变化证明了在超声提取的卵黄高磷蛋白中HDL的存在更多。研究人员还指出，在低功率和低温下，超声和微波处理不会改变蛋白质的二级结构，这与当前研究的结果一致并加以证实。
?1. B1 (microwave with 4?min power 180?W), B2 (microwave with 4?min power 360?W), B3 (microwave with 4?min power 600?W), B4 (microwave with 8?min power 180?W), B5 (microwave with 8?min power 360?W), B6 (microwave with 8?min power 600?W).">
?1. A1 (ultrasound with 4?min power 200?W), A2 (ultrasound with 4?min power 300?W), A3 (ultrasound with 4?min power 400?W), A4 (ultrasound with 8?min power 200?W), A5 (ultrasound with 8?min power 300?W), A6 (ultrasound with 8?min power 400?W).">
3.7 SDS-PAGE测定
图3和图4中在45–35kDa范围内观察到的条带对应于使用微波和超声方法提取的卵黄高磷蛋白。根据研究，在31–47kDa范围内的条带是卵黄高磷蛋白的指示，证实卵黄高磷蛋白以不同的组分存在。之前的研究以相似的分子量确认了卵黄高磷蛋白的存在。其他研究也通过液相色谱鉴定了分子量为35、41和47kDa的卵黄高磷蛋白组分，这支持了这些发现。相反，在116、90、66和15kDa处的条带与HDL蛋白相关。结果表明，超声提取的卵黄高磷蛋白显示出多种不同分子量的条带，其中UT8P400样品显示出最好的蛋白质条带。然而，所有样品中都存在HDL蛋白条带，表明在200–400W下处理4–8分钟的超声不足以分离HDL和纯化卵黄高磷蛋白。需要更高的功率和更长的持续时间。在UT8P400样品中，它具有最高的空化时间和功率，卵黄高磷蛋白峰增加，而HDL条带减少。研究人员指出，超声时间增加导致更多的空化气泡和更高的瞬时温度，导致HDL变性。他们使用600W处理10秒以获得最佳的卵黄高磷蛋白纯度，并警告说，过度的功率和时间会使卵黄高磷蛋白变性和沉淀。微波提取8分钟导致更多样化的卵黄高磷蛋白条带，观察到三个不同的条带，突出了该方法的有效性。在4分钟时，HDL条带更为突出，但MT8P600样品显示出更高的卵黄高磷蛋白纯度。微波时间和功率的增加导致更均匀的电泳条带和HDL变性。微波提取增强了分子内相互作用，特别是静电相互作用和氢键，同时破坏了蛋白质的稳定性。溶剂的氢键网络可能导致HDL收缩。这表明蛋白质基团如–OH、–NH2和–COOH受到微波的影响，导致键断裂和蛋白质结构的根本变化。
选择样品MT8P600（微波）和UT8P400（超声）进行后续DPPH自由基清除、ESI和EAI测试，以比较这些样品。
3.8 EAI和ESI
结果表明，UT8P400样品中的EAI和ESI（24.30–98.5）分别高于MT8P400样品（20.8–83.7）。这是因为超声样品含有HDL，这是一种磷脂化合物，比卵黄高磷蛋白具有更好的乳化性能。这两个参数的较高值表明样品的灵活性，这对于乳液稳定性至关重要。在一项研究中，报告了提取的卵黄高磷蛋白的EAI（27.14）和ESI（103.27）值，这与当前研究获得的结果相似并加以证实。研究报告了蛋黄中的EAI和ESI水平分别为49.11和90.00，与各种牛奶、小麦、豌豆和马铃薯蛋白相比具有最高的乳化性能，他们将其归因于LDL和HDL。与所研究的卵黄高磷蛋白相比，这更高。这是因为在卵黄高磷蛋白提取过程中应用了热量（80°C持续15分钟）。诸如LDL和HDL之类的蛋白质在加热（高于65°C）下会变性。然而，本研究中通过微波获得的卵黄高磷蛋白的EAI高于小麦蛋白分离物（11.60）。本研究中通过微波获得的卵黄高磷蛋白的ESI高于小麦蛋白分离物（79.33）、豌豆（74.33）、马铃薯蛋白分离物（78.67），等于乳清蛋白浓缩物（84.17）和酪乳粉（82.67）。这些发现表明卵黄高磷蛋白在乳化性能方面具有很高的功能价值。
3.9 DPPH自由基抑制
结果表显示，MT8P400样品的抗氧化特性（36.20%）高于UT8P400样品（23.58%），并具有更高的自由基抑制能力。因为UT8P400样品的纯度较低。在HDL和卵黄高磷蛋白之间建立了磷酸钙桥，这阻止了DPPH自由基的抑制。另一方面，MT8P400样品比UT8P400具有更高的卵黄高磷蛋白百分比，此外纯度更高。在之前的研究中，提取的卵黄高磷蛋白的抗氧化特性在21%到63%之间。此外，在另一项研究中，研究人员报告卵黄高磷蛋白抑制DPPH自由基10%。另一方面，在一项研究中，报告卵黄高磷蛋白的抗氧化能力在27.2%到53%之间。研究报告了卵黄高磷蛋白DPPH自由基抑制的最高和最低值分别为42%和21%，这与当前研究获得的结果相似并加以证实。
结论
在这项研究中，我们成功地证明了微波和超声技术在各种功率设置和暴露时间下从蛋黄中提取卵黄高磷蛋白的有效性。微波辅助提取表现出优于超声辅助方法的性能，与超声辅助方法相比，产生具有更高纯度和更高回收率的卵黄高磷蛋白。实验证据表明，增加微波功率和处理时间与卵黄高磷蛋白纯度和HDL去除效率呈正相关，这通过FT-IR光谱分析和SDS-PAGE电泳图谱得到证实。值得注意的是，在较低温度和较短时间内进行的超声辅助提取保留了天然蛋白质构象，表明其在蛋白质结构完整性至关重要时具有实用性。然而，对于优先考虑卵黄高磷蛋白纯度的应用，建议在超声处理期间延长处理时间和提高功率参数。从蛋黄中成功分离出高价值的卵黄高磷蛋白代表了解决当
