《Food Science & Nutrition》：Inhibition of IL-6/STAT3 Signaling by N-Trans-Hibiscusamide and Its Derivative in a Mouse Model of Collagen-Induced Arthritis
编辑推荐：
这篇研究论文深入探讨了N-反式-芙蓉酰胺（NHA）及其衍生物（HAD）在治疗类风湿关节炎（RA）中的作用机制。研究聚焦于关键的IL-6/STAT3信号通路，通过细胞和动物模型（胶原诱导性关节炎，CIA）证实，NHA和HAD能有效抑制该通路活化，减少促炎因子表达，并抑制辅助性T细胞17（Th17）的分化，从而显著改善关节炎症状。这为开发基于天然产物的新型RA治疗药物提供了重要的实验依据。
引言
类风湿关节炎（RA）是一种慢性自身免疫性疾病，以关节持续性炎症和进行性破坏为特征，导致疼痛、功能障碍和生活质量下降。白细胞介素6（IL-6）是一种关键的促炎细胞因子，通过激活下游炎症信号通路，在RA的发病机制中扮演着核心角色。IL-6介导的信号级联失调，特别是信号转导和转录激活因子3（STAT3）通路，导致了持续的炎症和疾病进展，使该轴成为一个重要的治疗靶点。靶向IL-6/STAT3通路已成为一种有前景的RA治疗策略。本研究探讨了N-反式-芙蓉酰胺（NHA）及其衍生物4-O-(E)-阿魏酰-N-(E)-芙蓉酰胺（HAD）对IL-6/STAT3信号轴的抑制作用和潜在机制。
材料与方法
本研究采用了多种体外和体内实验方法。体外研究使用了Hep3B（人肝癌细胞系）和U266（人多发性骨髓瘤细胞系）等细胞模型。通过稳定表达磷酸化STAT3（pSTAT3）荧光素酶报告基因的Hep3B细胞，评估了NHA和HAD对IL-6诱导的荧光素酶活性的影响。通过定量实时逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）分析了IL-6诱导基因（如CRP、IL-1β、ICAM-1、SOCS3）的表达。通过免疫细胞化学和蛋白质印迹（Western blot）分析了STAT3的核转位及其磷酸化水平，并检测了IL-6信号通路关键分子（JAK2、STAT3、ERK）的磷酸化状态。此外，还进行了IL-6/IL-6受体（IL-6R）结合试验。体内研究采用了胶原诱导性关节炎（CIA）小鼠模型。DBA/1小鼠通过免疫鸡II型胶原（CII）诱导关节炎，之后腹腔注射NHA或HAD（10或30 mg/kg）进行治疗。评估指标包括关节炎临床评分、血清中抗CII免疫球蛋白G（IgG）和IL-17A的水平、脾脏中Th17特异性基因的表达，以及体外Th17细胞分化实验。
结果
1. NHA和HAD抑制IL-6诱导的STAT3活性和基因表达
在表达pSTAT3荧光素酶报告基因的Hep3B细胞中，NHA和HAD能显著抑制IL-6诱导的荧光素酶活性，且无细胞毒性。qRT-PCR结果显示，两者能剂量依赖性地下调IL-6诱导的CRP、IL-1β、ICAM-1和SOCS3基因的表达。
2. NHA和HAD抑制STAT3核转位
免疫荧光染色和蛋白质印迹分析表明，IL-6处理增加了磷酸化STAT3（pSTAT3）的核内定位和总水平，而NHA和HAD预处理可显著抑制这种核转位。
3. NHA和HAD抑制IL-6信号通路关键分子的磷酸化
蛋白质印迹分析显示，在U266细胞中，NHA和HAD能有效降低IL-6诱导的JAK2、STAT3和ERK的磷酸化水平，表明它们能抑制IL-6信号通路的上游和下游关键事件。
4. NHA和HAD影响IL-6与IL-6R的结合
通过均相时间分辨荧光（HTRF）结合试验和改良的固相配体结合试验证实，NHA和HAD能够降低IL-6与IL-6R之间的结合亲和力，这可能是其抑制下游信号传导的机制之一。
5. NHA和HAD减轻CIA小鼠的关节炎症状
在CIA小鼠模型中，腹腔注射NHA或HAD能显著降低关节炎临床评分，减轻足爪的红肿现象。同时，治疗组小鼠血清中的抗CII IgG和IL-17A水平也显著下降。
6. NHA和HAD下调脾脏中Th17特异性基因表达
从CIA小鼠脾脏提取的RNA进行qRT-PCR分析显示，NHA和HAD处理能下调Th17细胞的特异性标志基因，如IL-17A、视黄酸相关孤儿受体γT（RORγT）和趋化因子受体6（CCR6）的表达。
7. NHA和HAD抑制体外Th17细胞分化及STAT3磷酸化
从小鼠脾脏分离的初始CD4+T细胞，在向Th17细胞分化的条件培养基中培养时，加入NHA或HAD可抑制其向Th17细胞的分化。蛋白质印迹分析进一步证实，在分化过程中，NHA和HAD能抑制STAT3的磷酸化。
讨论
本研究结果表明，NHA和HAD通过干扰IL-6与IL-6R的结合，进而抑制JAK2/STAT3信号通路的活化，最终导致下游促炎基因表达下调以及Th17细胞分化受阻。在CIA模型中，这种多层次的抑制作用转化为了显著的疾病缓解效果，包括关节炎症状减轻和自身免疫反应指标下降。尽管先前已有针对IL-6/STAT3通路的抑制剂（如AG490、Stattic）的研究，但本研究首次报道了从植物Portulaca oleracea中分离得到的NHA及其衍生物HAD在该通路上的抑制作用及其在CIA模型中的治疗效果，为开发新型天然抗RA药物提供了候选化合物和理论依据。不过，本研究也存在一定局限性，例如对NHA/HAD与IL-6/IL-6R结合的具体位点和亲和力尚未完全阐明，其药代动力学和长期安全性也有待进一步评估。
结论
综上所述，本研究首次证明了N-反式-芙蓉酰胺（NHA）及其衍生物（HAD）能够通过抑制IL-6/STAT3信号通路，有效缓解胶原诱导性关节炎的疾病进展。其作用机制涉及干扰IL-6/IL-6R结合、抑制下游JAK2/STAT3磷酸化与核转位、下调促炎基因表达以及抑制Th17细胞分化等多个环节。这些发现凸显了NHA和HAD作为治疗类风湿关节炎等IL-6/STAT3通路相关疾病的潜在天然化合物候选药物的价值，为后续的药物开发和临床转化研究奠定了坚实的基础。
