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本研究揭示了黄芪多糖(APS)通过调节肠道菌-肠-脑轴，有效改善3xTg AD小鼠认知功能和病理特征的机制。其核心在于重塑肠道菌群（如增加Akkermansia，减少Alistipes）、修复肠黏膜屏障（上调ZO-1、Occludin等紧密连接蛋白），并系统性抑制肠、外周及大脑的炎症反应（调节TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β等细胞因子），从而减轻Aβ沉积、tau蛋白磷酸化及神经胶质细胞过度活化，为AD的菌群靶向治疗提供了新策略。
黄芪多糖对阿尔茨海默病认知障碍的改善作用与机制
1 引言
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease, AD)是一种全球性的神经退行性疾病，是导致老年人认知能力下降的主要原因，其病理特征包括β-淀粉样蛋白(amyloid-beta, Aβ)的异常沉积、tau蛋白的过度磷酸化、神经炎症、氧化应激以及突触功能障碍和神经元丢失。然而，目前包括aducanumab、lecanemab、多奈哌齐等在内的药物疗法仅能提供短暂的症状缓解，无法从根本上改变疾病进程，这凸显了开发新型疾病修饰疗法的迫切性。
近年来，微生物-肠-脑轴被定位为神经退行性疾病的关键调节器。研究表明，肠道菌群失调既是AD病理的结果，也可能是其致病因素，甚至可能先于明显的神经病理学改变出现。这种失调可促进神经炎症、损害Aβ清除并破坏肠-脑信号传导。因此，调节肠道菌群为AD干预提供了一个前景广阔但机制尚未完全理解的途径。
黄芪多糖(Astragalus polysaccharides, APS)是中药黄芪的主要生物活性成分，以其抗炎、免疫调节和神经保护特性而闻名。近期研究表明，APS可以调节肠道菌群组成、恢复微生物平衡并增强肠道屏障完整性。初步实验证据表明，APS可以减轻AD小鼠模型的认知缺陷和Aβ病理。然而，这些观察性发现与机制理解之间仍存在关键空白。本研究假设APS通过重塑肠道菌群和调节微生物-肠-脑轴的稳态来改善AD认知障碍。为此，我们对不同剂量APS处理的三转基因(3xTg) AD小鼠进行了16S rRNA测序和多维分析，旨在阐明APS如何影响AD发病机制，从而为AD提供一种新型的微生物靶向治疗策略。
2 材料与方法
本研究使用了48只雌性3xTg AD小鼠和12只野生型(WT) C57BL/6J同窝小鼠。AD小鼠被随机分为四组：模型组(AD)、APS低剂量组(APSL, 50 mg/kg)、APS中剂量组(APSM, 100 mg/kg)和APS高剂量组(APSH, 200 mg/kg)，WT小鼠作为对照组。所有组别连续4周每日灌胃给药。给药结束后，通过Morris水迷宫(Morris water maze, MWM)测试评估小鼠的空间学习和记忆能力。收集新鲜粪便样本进行16S rRNA测序以分析肠道菌群组成。采集大脑和肠道组织，通过免疫荧光(immunofluorescence, IF)、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)、蛋白质印迹(Western blotting)和酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)等技术，检测Aβ沉积、tau蛋白磷酸化、紧密连接蛋白表达、神经胶质细胞活化以及炎症因子水平。
3 结果
3.1 APS增强3xTg小鼠的学习能力
MWM测试结果显示，APS治疗以剂量依赖的方式改善了3xTg小鼠的空间学习和记忆缺陷。在隐藏平台训练阶段，与AD模型组相比，APS处理组（尤其是高剂量组）找到平台的潜伏期显著缩短。在探测试验中，APS高剂量组小鼠在目标象限停留的时间和穿越原平台位置的次数也显著增加，表明其空间记忆得到改善。
3.2 APS减轻3xTg小鼠的神经病理学标志
研究评估了APS对AD典型病理的影响。免疫组化分析显示，APS干预减少了海马CA1区的Aβ沉积。蛋白质印迹结果进一步表明，APS处理降低了磷酸化tau蛋白(P-Tau)、β-分泌酶1(BACE1)和早老素-1(presenilin-1, PS-1)的水平，同时显著升高了α-分泌酶ADAM10的表达。这些结果表明APS干预有效缓解了3xTg小鼠的神经病理学特征。
3.3 APS减轻3xTg小鼠的神经炎症
神经炎症是AD的一个初始且持续的特征，由小胶质细胞和星形胶质细胞介导。免疫荧光分析显示，3xTg小鼠海马齿状回(dentate gyrus, DG)和大脑皮层中的胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP，星形胶质细胞标记)和离子钙接头蛋白1(ionized calcium-binding adapter molecule 1, Iba-1，小胶质细胞标记)信号显著增强，表明胶质细胞过度活化。APS治疗，特别是高剂量，显著下调了DG区的GFAP以及DG和皮层的Iba-1荧光信号。此外，ELISA检测发现，APS处理上调了脑组织匀浆中抗炎细胞因子IL-4、IL-10和TGF-β的水平，同时下调了促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，其中IL-6的变化最为显著。蛋白质印迹也证实了IL-6表达的降低。这些结果表明APS通过抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的活化来减轻神经炎症。
3.4 APS干预可降低3xTg小鼠肠道组织和外周炎症水平
肠-脑轴失调与炎症反应密切相关，被认为是驱动AD发病的关键机制。ELISA检测显示，在空肠组织和血清中，AD模型组的促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平升高，而抗炎细胞因子(IL-4、IL-10、TGF-β)水平降低。APS干预以剂量依赖的方式逆转了这种促炎状态，恢复了细胞因子平衡。这表明APS有效缓解了3xTg小鼠的中枢和全身性炎症。
3.5 APS增强肠道屏障完整性
为了评估APS对屏障完整性的影响，研究人员分析了空肠黏膜结构。苏木精-伊红(hematoxylin and eosin, H&E)染色显示，WT小鼠的空肠绒毛高大、密集、排列规则。相比之下，AD模型组小鼠的绒毛不规则缩短、绒毛间隙增宽、隐窝加深、基底膜变薄。APS治疗逆转了这些异常，其中高剂量组的改善最为明显。免疫组化染色进一步揭示，AD模型组小鼠空肠紧密连接蛋白闭合蛋白(Occludin)和闭锁小带蛋白-1(zonula occludens-1, ZO-1)的免疫反应性最低。定量分析证实，APS处理，特别是高剂量，显著恢复了这两种紧密连接蛋白的表达水平。这些发现表明APS有效减轻了黏膜损伤，并通过增加紧密连接蛋白的表达增强了肠道屏障功能。
3.6 APS恢复AD小鼠肠道微生物丰度
通过对粪便样本进行16S rRNA测序，评估了APS如何重塑3xTg AD小鼠的肠道菌群。在门水平上，APS干预，特别是高剂量，显著增加了拟杆菌门(Bacteroidetes)的丰富度，并倾向于抑制厚壁菌门(Firmicutes)、疣微菌门(Verrucomicrobiota)和帕氏菌门(Patescibacteria)，改变了AD小鼠肠道菌群的门水平构成。在属水平上，分析了丰度较高的10个分类单元，其中Alistipes、Ligilactobacillus、Akkermansia和Lachnospiraceae_NK4A136_group的变化更为明显。WT小鼠的Ligilactobacillus和Akkermansia水平显著高于AD组，而Alistipes水平显著低于AD组。APS处理强烈抑制了Alistipes的丰度，其中低剂量和高剂量组的效果最强。值得注意的是，APS中剂量独特地促进了Akkermansia的非显著性扩张。这揭示了Alistipes和Akkermansia在APS治疗的AD小鼠肠道菌群丰富度恢复中的潜在作用。
3.7 APS对肠道微生物多样性的影响
计算α多样性指数（观测物种数、香农指数、辛普森指数和Chao1指数）以评估肠道菌群的多样性。与AD组相比，APS给药以剂量依赖的方式提高了所有四项指数，表明APS倾向于增加3xTg小鼠肠道微生物的α多样性。
β多样性分析用于量化粪便微生物组之间的组成差异。基于布雷-柯蒂斯(Bray-Curtis)距离的主坐标分析(principal coordinate analysis, PCoA)显示，WT小鼠与APS处理组之间存在清晰的分离，表明APS有潜力改变3xTg小鼠的肠道菌群组成。
线性判别分析效应大小(linear discriminant analysis effect size, LEfSe)分析用于识别区分治疗组的微生物特征。结果显示，APS以剂量依赖的方式重塑了肠道菌群，其中高剂量APS组的微生物特征与WT小鼠最为接近。
4 讨论
本研究表明，APS通过调节肠道菌群和加强肠道屏障，从而缓解全身和神经炎症反应，最终改善3xTg小鼠的认知缺陷和核心神经病理学变化。在机制上，APS增加了α-分泌酶ADAM10的表达并抑制了β-分泌酶BACE1的水平，可能通过调节相关信号通路影响淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein, APP)的加工。同时，APS通过上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达来加强肠道屏障，并改善肠道结构。研究还发现，APS减轻了AD模型小鼠肠道组织、血清和脑组织中升高的促炎细胞因子水平，同时促进了抗炎因子的表达。因此，APS可能通过调节肠道菌群、加强肠道屏障、降低促炎细胞因子水平以及减轻炎症性神经毒性和Aβ/tau病理，来改善3xTg小鼠的认知障碍和病理表型。
肠道菌群失调是外周和中枢系统促炎细胞因子升高的重要来源。肠道菌群多样性的减少或有害细菌的增加会损害肠道屏障。肠道屏障的完整性对于限制炎症因子（如IL-1β和TNF-α）进入体循环至关重要。肠道屏障的损伤允许微生物产物（如内毒素）渗入血液，激活免疫反应，增加血脑屏障的通透性，刺激中枢免疫细胞，并最终加剧神经炎症。本研究发现，APS处理显著降低了Alistipes的丰度，同时富集了Akkermansia和Lachnospiraceae_NK4A136_group等有益菌属。在AD研究中，Alistipes被明确认为是与疾病诊断显著相关的六个风险属之一，其丰度在AD患者肠道中显著升高，被归类为可能通过加剧神经炎症和破坏神经递质平衡来驱动疾病进展的促炎细菌。Akkermansia已被证明可以通过产生短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)来抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)通路，从而缓解神经炎症，并加强肠道屏障功能。Lachnospiraceae科的许多成员是SCFAs，特别是丁酸盐的关键生产者，而SCFAs是结肠上皮细胞的主要能量来源，在维持肠道上皮完整性和支持肠道屏障调节中起着至关重要的作用。拟杆菌门与厚壁菌门比值的降低与AD模型中的全身性炎症和神经病理学有关。
5 结论
本研究表明，APS通过重塑肠道微生物多样性和丰度（最显著的是调节Akkermansia和Alistipes的相对丰度），通过上调紧密连接蛋白恢复肠道屏障完整性，并抑制全身和中枢炎症反应，从而缓解3xTg AD小鼠的学习缺陷、减少Aβ沉积并减轻神经炎症。基于这些发现，未来的研究应整合宏基因组学、代谢组学和粪便微生物群移植，以剖析APS-肠-脑轴背后的分子网络，并开展多中心临床试验以验证其转化潜力。
