《Analytical Science Advances》：Metabolomic Differentiation of Malpighiaceae From Dry and Humid Tropics via UHPLC-MS/MS and Chemometrics
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本研究整合超高效液相色谱串联质谱（UHPLC-MS/MS）与偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）的变量重要性投影（VIP）评分，首次从代谢组学层面系统揭示了水分可及性对巴西干旱（塞拉多、卡廷加）与湿润（大西洋雨林、亚马逊雨林）热带生境中金虎尾科（Malpighiaceae）植物叶片次生代谢物合成的调控作用。文章鉴定了如矢车菊素-3-O-接骨木二糖苷和3,4-二-O-没食子酰奎宁酸等关键差异化合物，并注释了15种该科植物中此前未报道的代谢物，为解析植物应对季节性水分胁迫的代谢适应机制提供了新的分析策略与见解。
引言
多种因素可引发植物，尤其是生长在干旱热带地区植物的水分胁迫。为了在此类条件下生存，植物会产生具有适应功能的代谢物。然而，关于在巴西干旱和湿润热带地区栽培的金虎尾科物种叶片的代谢组学数据仍然匮乏。本研究旨在评估栖息于巴西对比鲜明生物群系（塞拉多和卡廷加（干旱地区），以及大西洋雨林和亚马逊雨林（湿润地区））的10种（来自7个属）金虎尾科植物的季节性水分胁迫。通过液相色谱-质谱联用获得的代谢谱，使用偏最小二乘法判别分析（Partial Least Squares Discriminant Analysis, PLS-DA）的变量重要性投影（Variable Importance in Projection, VIP）评分进行比较。
材料与方法
化学试剂与材料
研究使用的溶剂包括乙醇、甲酸和甲醇，以及乙腈和超纯水。提取阶段使用的设备包括组织研磨仪和旋转蒸发仪。代谢物分离和检测采用配备反相C18UHPLC柱的超高效液相色谱系统，并与电喷雾电离四极杆飞行时间质谱仪（Electrospray Ionization Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer, ESI-Q-TOF MS）联用。使用特定化合物进行质谱校正。
植物材料与提取物制备
在2014年至2018年间，从生长在巴西不同生物群系的7个属10种金虎尾科植物中收集了总计30份成年叶片样本。采集后，叶片在40°C下干燥3天，然后研磨成均匀粉末。准确称取20 mg叶片粉末，用1 mL乙醇与水的混合溶剂（4:1, v/v）进行提取。提取过程包括使用机械振荡器匀浆、离心，转移上清液并使用旋转蒸发仪除去溶剂，最终将提取物于-80°C保存直至色谱分析。
UHPLC-MS/MS色谱分析
色谱分析前，将叶片提取物复溶于甲醇:水（4:1 v/v）中，并加入内标。色谱分析在配备C18反相色谱柱的UHPLC系统上进行，使用电喷雾电离源的四极杆飞行时间质谱仪作为质量分析器。流动相为含0.1%甲酸的超纯水（A）和乙腈（B），采用梯度洗脱程序，流速为0.5 mL min-1，进样体积为5 μL。质谱扫描范围为50–2000 Da，采用正离子和负离子两种模式。采集的数据使用MZmine软件进行处理，包括质量检测、色谱图构建、去卷积、同位素峰分组和峰对齐等步骤。原始色谱图已在MassIVE平台公开。
基于VIP评分（PLS-DA）的化学计量学分析
为了鉴定在生境水平上区分不同金虎尾科植物叶片的代谢物，将UHPLC-MS/MS获得的氢乙醇叶片提取物色谱谱图进行比较，使用了PLS-DA，特别是VIP评分。为正离子和负离子模式分别创建矩阵，提交至MetaboAnalyst进行PLS-DA分析，数据经过归一化、对数转换和自动缩放预处理。通过交叉验证获得的Q2和R2参数来验证VIP评分PLS-DA模型。
通过UHPLC-MS/MS对色谱谱图中代谢物的注释
通过使用NIST、Massbank和Spectral Match等谱图库，对10种金虎尾科植物叶片的UHPLC-MS/MS谱图中的代谢物进行注释。该注释被归类为2b级，即基于分子式和MS2碎片，使用在线谱图库进行计算工具比对和确认。
结果与讨论
通过UHPLC-MS/MS获得的金虎尾科叶片色谱谱图与基于VIP的PLS-DA化学计量学鉴别相结合，为探索次生代谢物组成提供了一条高分辨率的分析途径。
基于正离子模式UHPLC-MS/MS谱图的得分图与VIP评分（PLS-DA）
基于正离子模式UHPLC-MS/MS谱图的PLS-DA得分图证实了在干旱和湿润热带地区栽培的金虎尾科物种合成的次生代谢物存在差异。来自湿润环境（大西洋雨林或亚马逊雨林）的叶片样本点以95%的置信度聚集在成分1的正区域，而来自干旱热带地区（塞拉多和卡廷加）的叶片样本点则位于同一成分的负区域。这些结果表明，季节性水分胁迫在调节特定次生代谢物的合成中起着关键作用。
VIP评分用于识别区分干旱和湿润热带地区植物样本的代谢物。VIP值大于1.9的代谢物被认为对区分环境条件最为重要。总共14种在正离子模式下检测到的代谢物显示了VIP评分，其中13种在干旱热带地区的叶片中表现出更高的相对强度。
最高的VIP评分归属于矢车菊素-3-O-接骨木二糖苷，这是一种花青素类代谢物。在卡廷加生物群系栽培的Banisteriopsis malifolia叶片中该化合物强度最高。花青素是植物组织在特定生长阶段或响应环境刺激（如可见辐射和水分胁迫）时合成的色素。在干旱条件下，植物细胞失水可导致脱水甚至质壁分离，进而刺激花青素（尤其是叶片中）的产生和积累。这些化合物通过降低渗透势、增强水分吸收和减少蒸腾损失来提高植物的耐旱性。除了这些生理作用外，花青素还提供光保护和抗氧化活性，使植物能够耐受次优的水分可用性。因此，矢车菊素-3-O-接骨木二糖苷是来自苯丙烷途径的关键花青素，其上调广泛与增强抗氧化防御相关，以应对干旱诱导的氧化应激。
据估计，干旱环境中叶片的花青素浓度可比非胁迫条件下高出四倍。这强化了矢车菊素-3-O-接骨木二糖苷作为区分干旱和湿润热带地区的关键鉴别化合物的作用。其他化合物如类固醇蜕皮甾酮（14）以及黄酮类化合物牡荆素-2-O-鼠李糖苷（5）和异牡荆素-2-O-阿拉伯糖苷（4）也对区分有贡献，尽管VIP值较低。这些代谢物同样与增强植物在干旱环境中活力的适应性反应有关。
此外，UHPLC-MS/MS谱图（正离子模式）揭示了所研究物种中此前未报道的代谢物的存在。六种化合物首次在这些金虎尾科物种中被注释：异牡荆素-2-O-阿拉伯糖苷（4）、牡荆素-2-O-鼠李糖苷（5）、飞燕草素-3-O-6-O-α-鼠李吡喃糖基-β-葡萄吡喃糖苷（6）、矢车菊素-3-O-接骨木二糖苷（7）、山柰酚-O-戊糖基-戊糖苷乙酸酯（10）和染料木素-二-C-己糖苷（11）。
基于负离子模式UHPLC-MS/MS代谢组谱图的得分图与VIP评分（PLS-DA）
基于负离子模式UHPLC-MS/MS获得的色谱谱图的PLS-DA得分图的化学计量学分析也揭示了所研究植物样本之间的明显区分。位于成分1正区域的得分（三角形）对应于在湿润热带地区（包括大西洋雨林和亚马逊雨林）栽培的叶片样本。相反，代表来自干旱热带地区（特别是塞拉多和卡廷加生物群系）叶片的点用圆圈表示，并聚集在成分1的负区域。
应用VIP评分来识别与观察到的区分相关的代谢物。总共22种化合物被列入VIP评分分析，每种代谢物根据其对干旱和湿润热带地区叶片之间代谢组学差异的贡献被赋予一个评分。
最高的VIP评分（负离子模式）归属于酚类化合物3,4-二-O-没食子酰奎宁酸，该化合物在塞拉多生物群系栽培的Byrsonima coccolobifolia叶片中显示出最大的相对强度。因此，该化合物是区分热带环境的最重要贡献者。第二高的VIP评分归属于代谢物（3），同样是一种酚类化合物，被鉴定为1-(4-羟基苯基)-3-[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己-2-基]氧代丙烷-1-酮。该化合物对应的分子离子首次在Niedenzuella poeppigiana、Heteropterys intermedia和Heteropterys leona的叶片中检测到。
与花青素不同，并非所有酚类化合物在干旱环境中都表现出更高的水平。代谢物（1）和（3）就是例证。尽管已知水分胁迫会激活酚类化合物的生物合成途径，但代谢物（1）在干旱地区积累而代谢物（3）在湿润地区更普遍的原因尚不清楚。然而，研究结果表明酚类化合物——特别是代谢物（1）和（3）——在区分不同热带环境中的金虎尾科叶片方面起着重要作用。
3,4-二-O-没食子酰奎宁酸与源自莽草酸的没食子酸/鞣花酸途径相关，该途径有助于在水分有限的情况下清除活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）、保护细胞膜和进行胁迫信号传导。我们分析中观察到的这些化合物的差异积累支持了这样一个观点，即水分稀缺条件调节次生代谢通量朝向酚类生物合成。这些发现为干旱胁迫下发生的代谢调整提供了机制性见解，并突出了未来研究关注通路水平调控和胁迫适应性代谢物生产的有希望靶点。
通过UHPLC-MS/MS在负离子模式下获得的色谱谱图还导致了对所研究金虎尾科物种中九种此前未报道代谢物的注释：3,4-二-O-没食子酰奎宁酸（1）、奎宁酸（2）、1-(4-羟基苯基)-3-[(2R,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)氧杂环己-2-基]氧代丙烷-1-酮（3）、咖啡酸（4）、3,4-二-O-咖啡酰奎宁酸（6）、2-辛-1-烯-3-基氧基-6-[(3,4,5-三羟基氧杂环己-2-基)氧代甲基]氧杂环己烷-3,4,5-三醇（7）、槲皮素-3,4-O-二-β-葡萄糖苷（8）、1,3,4-三羟基-5-[(E)-3-(4-羟基苯基)丙-2-烯酰]氧代环己烷-1-羧酸（12）和木犀草素-2-O-葡萄糖苷（14）。
结论
本研究通过高分辨率UHPLC-MS/MS和稳健的多变量化学计量学分析，首次揭示了金虎尾科物种对季节性水分胁迫的代谢反应，显示了干旱和湿润热带环境之间代谢物合成的显著差异。鉴定出包括矢车菊素-3-O-接骨木二糖苷和3,4-二-O-没食子酰奎宁酸在内的15种代谢物作为关键区分标志，代表了一个重要的分析里程碑，因为这些化合物是在该植物科中首次报道。
通过整合UHPLC-MS/MS色谱数据集与化学计量学鉴别，本研究建立了一个全面且高分辨率的分析策略，能够阐明对比鲜明的环境条件如何调节代谢生物合成。这个集成框架增强了可解释性，提高了分析稳健性，并清楚地突出了所实现的方法学创新，使该工作成为对分析科学的相关贡献。此外，该方法显示出适用于更广泛代谢组学研究的强大潜力，特别是在复杂且受环境驱动的生物基质中。
通过建立水分可及性与次生代谢物生物合成之间的明确关联，该研究推进了我们对植物对非生物胁迫适应策略的理解。除了有助于未被充分研究的分类群的植物化学图谱绘制外，这些发现为未来的生态和生理学研究，以及旨在利用胁迫恢复力机制进行农业改良、天然产物发现和生物多样性保护的生物技术应用提供了一个有价值的框架。
未来的研究应优先深入阐明在对比鲜明的水分可及性条件下观察到的次生代谢物差异生物合成背后的代谢途径和调控机制。将代谢组学与转录组学、蛋白质组学和通量组学方法相结合，对于确定特定的酶促通路在季节性水分胁迫期间如何被激活、抑制或重新配置至关重要。此外，对其他金虎尾科属以及系统发育相关科进行比较分析，可以阐明此处识别的代谢特征是否代表了谱系特异性适应或更广泛的胁迫响应策略。推进这些机制和通路导向的研究，不仅将加深我们对植物对非生物胁迫恢复力的理解，还将增强对具有生态、农艺和生物技术相关性的代谢性状的战略利用。
