《Apoptosis》：Spatially defined danger zone shapes gastric cancer progression through CCDC80+ fibroblast–induced CD8+ T cell dysfunction
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本研究通过整合空间转录组、单细胞测序及功能实验，在侵袭性胃癌中发现了一个独特的基质-免疫-血管核心区域，即“危险区”。该区域富集于弥漫型胃癌，并与晚期分期、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）及不良预后相关。研究者基于危险区特征基因将患者分为预后显著不同的亚型，并构建了基于13个关键基因（包括CCDC80、MSRB3、FBLN1、SPARCL1等）的XGBoost分类器用于精准预测。机制上，研究首次揭示了危险区内CCDC80+成纤维细胞通过上调CXCL12表达，经CXCL12–CXCR4轴募集效应CD8+T细胞，并显著上调其PD-1和TIM-3表达，诱导其功能障碍、耗竭和凋亡，从而促进肿瘤进展和免疫逃逸。此外，研究还成功构建了可直接从常规H&E病理切片预测危险区评分的LightGBM模型。该工作不仅定义了胃癌进展和免疫抑制的关键空间特征，还为临床提供了新型生物标志物、预后工具及潜在的治疗靶点。
引言
胃癌（GC）是全球癌症相关死亡的第二大原因，其显著的异质性与肿瘤微环境（TME）密切相关，导致治疗抵抗和预后不良。现有基于大样本转录组学的分子分型（如TCGA和ACRG分型）未能完全捕捉胃癌TME在空间层面的复杂性。随着单细胞和空间组学技术的发展，对TME的研究已从整体水平进入时空相互作用分析时代。本研究旨在从空间转录组学层面定义胃癌发生发展的核心区域，并深入探究其背后的细胞互作机制及其对患者预后异质性的影响。
材料与方法
研究获得了胃癌患者的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）手术标本，并通过了伦理委员会批准。为识别高侵袭性胃癌模型中的空间核心区域，研究者利用了KRAS突变联合p53缺失（KP）的胃癌小鼠模型的空间转录组数据集（GSE186290）以及人类胃癌空间转录组数据集（GSE251950）。同时，整合了包括ACRG、TCGA-STAD在内的近2000例胃癌患者的bulk转录组数据，以及GSE167297、GSE163558等单细胞RNA测序数据进行分析。研究采用了Seurat、SPOTlight、RCTD、CellChat、COMMOT、MistyR等多种生物信息学工具进行空间和单细胞数据分析，并利用NMF（非负矩阵分解）进行患者分型，应用包括XGBoost、LightGBM在内的机器学习算法构建预测模型。体外实验方面，利用小鼠NIH-3T3成纤维细胞系过表达CCDC80，并与从小鼠脾脏分离的CD8+T细胞进行共培养，通过流式细胞术、qRT-PCR、Western blot、ELISA和免疫荧光等技术验证分子机制。
结果
1. 空间转录组学鉴定出侵袭性胃癌的基质、血管和免疫核心区域
通过对高侵袭性小鼠胃癌模型（GAN-KP）进行空间转录组分析，研究者鉴定出12个转录簇。其中，位于肿瘤浆膜层附近的Cluster 3（后命名为“危险区”）显著高表达免疫细胞（Ptprc）、基质细胞（Pecam1, Acta2, Vwf）和血管内皮细胞（Vwf）的标志物。功能富集分析显示，该簇的标记基因在细胞外基质组织、血管生成和免疫应答等通路中显著富集。生存分析表明，Cluster 3的基因特征与患者最差预后密切相关。伪时序分析提示Cluster 3可能是从Cluster 1向Cluster 4过渡的中间状态。
2. 人类空间转录组学与病理学证实“危险区”的存在及其临床意义
在人类胃癌队列（ACRG）中验证发现，危险区评分与AJCC分期升高、Lauren分型中的弥漫型以及ACRG分子分型中的MSS/EMT亚型（以晚期、高复发、腹膜播散和预后极差为特征）显著正相关。在9例人类胃癌空间转录组切片中，弥漫型或混合型患者的危险区评分显著高于肠型患者，并且空间上可见清晰的高评分区域。危险区评分与ESTIMATE算法计算的基质评分、免疫评分高度相关，并且与MCP-counter评估的成纤维细胞、内皮细胞及多种免疫细胞的浸润水平正相关。空间邻域网络分析显示，在弥漫型样本的危险区内，基质细胞与免疫细胞之间存在密集的相互作用网络。此外，危险区评分高的患者更可能为微卫星稳定（MSS）状态，对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗的预测应答率更低，且与TIDE算法中的癌相关成纤维细胞（CAF）评分和T细胞功能障碍评分呈正相关。在IMvigor210（接受PD-L1阻断治疗的尿路上皮癌）队列中，高危险区评分同样与更差的总生存期及疾病稳定/进展的治疗结局相关。
3. 基于危险区的胃癌分型及机器学习预测模型
利用危险区标记基因，通过NMF方法将ACRG队列的胃癌患者分为两个亚型（亚型1和亚型2）。亚型2具有更高的危险区评分、更差的生存预后、更高的基质/免疫评分以及更免疫抑制的微环境（如M2型巨噬细胞浸润增多、抗原提呈细胞减少）。亚型2患者对ICI和多种化疗药物（如甲氨蝶呤、紫杉醇）的预测敏感性更低。通过Boruta随机森林和LASSO回归，研究者从140个NMF特征基因中筛选出13个关键基因（MARCKSL1, CFB, AIDA, SRGN, IGFBP7, ACTA2, SPARCL1, COL8A1, CCDC80, GAS1, MSRB3, COL6A3, FBLN1），并构建了包含XGBoost、LightGBM等7种算法的集成机器学习分类器。其中，XGBoost模型性能最优。SHAP分析显示，CCDC80、MSRB3、FBLN1和SPARCL1是区分亚型最重要的贡献基因。该XGBoost分类器在TCGA、GSE84437等多个独立验证队列中均能有效区分出预后显著不同的患者亚型。基因组学分析发现，亚型2具有更低的肿瘤突变负荷（TMB），且更倾向于MSS状态。
4. CCDC80+成纤维细胞是危险区内的关键调控细胞
单细胞分析显示，13个关键分类器基因在基质细胞，特别是成纤维细胞中表达最高。在包含多个转移灶的单细胞数据集中，成纤维细胞的该基因特征评分在肿瘤组织中高于癌旁组织，且在淋巴结和肝转移灶中最高。在TCGA数据中，CCDC80是唯一在肿瘤组织中表达显著上调的Top4关键基因。免疫荧光证实，在弥漫型胃癌中，CCDC80与成纤维细胞活化蛋白（FAP）存在显著的共定位。CellChat细胞通讯分析发现，CCDC80+成纤维细胞比CCDC80-成纤维细胞与CD8+T细胞、B细胞等免疫细胞有更强的相互作用，特别是通过CXCL12-CXCR4、MDK-NCL等配体-受体对。GSEA分析表明CCDC80+成纤维细胞抗原提呈相关通路缺失。转录因子分析（pySCENIC）揭示FOS和FOSB是CCDC80+成纤维细胞的特异性高活性转录因子。生存分析显示，CCDC80高表达与多个队列的不良预后相关。
5. 空间水平上CCDC80+成纤维细胞对CD8+T细胞的显著影响
空间转录组的RCTD去卷积和SPOTlight相关性分析显示，在弥漫型样本中，CCDC80+成纤维细胞与CD8+T细胞的空间相关性显著强于CCDC80-成纤维细胞。MistyR空间共定位分析进一步证实，在弥漫型胃癌的危险区内，CCDC80+成纤维细胞在细胞内和近细胞距离上与CD8+T细胞有更强的共定位。空间邻域网络分析呈现出CCDC80+成纤维细胞在危险区内“包裹”CD8+T细胞的独特结构。COMMOT空间信号流分析鉴定出危险区内存在显著的CXCL12–CXCR4配体-受体信号轴，免疫荧光显示表达CCDC80的成纤维细胞也高表达CXCL12。
6. 危险区募集效应CD8+T细胞并诱导其耗竭
将CD8+T细胞细分为效应性（CD8_eff）和耗竭性（CD8_exhau）亚群并进行空间映射，发现危险区内主要富集的是CD8_eff，而CD8_exhau则弥散分布在危险区外围和肿瘤区域内。空间CellChat分析表明，CCDC80+成纤维细胞通过CXCL信号通路与CD8_eff的通讯更强，且CXCL12–CXCR4通路是CCDC80+成纤维细胞特异性激活的。stlearn发育轨迹分析提示，浸润肿瘤的耗竭性CD8+T细胞可能起源于危险区。体外功能实验证实，过表达CCDC80的小鼠成纤维细胞能显著上调CXCL12的表达和分泌。当与活化的小鼠CD8+T细胞共培养时，CCDC80过表达的成纤维细胞能显著上调T细胞上的耗竭标志物PD-1和TIM-3，而这一效应可被CXCL12中和抗体所逆转。
7. 基于H&E染色病理切片预测危险区评分
研究者从TCGA-STAD队列获取了全切片图像（WSI），利用Histolab进行网格划分，并通过预训练的ResNet-50模型提取每个图像块的特征，构建了基于LightGBM回归器的危险区评分预测模型。模型在训练集和测试集上均表现出良好的预测性能（测试集Pearson相关系数0.7302）。将预测评分映射回病理切片可视化发现，高预测评分的区域主要对应于成纤维细胞样细胞高浸润的基质区域，而肿瘤纯度高的区域评分较低。生存分析显示，基于病理图像预测的危险区评分是显著的不良预后因素。
讨论
尽管胃癌的全球发病率和死亡率有所下降，但其仍是常见的恶性肿瘤之一，尤其在东亚国家。手术切除仍是根治性治疗的核心，因此理解术后肿瘤标本的空间生物学对于改善患者分层和治疗决策至关重要。本研究通过空间转录组学分析，在胃腺癌中发现了一个独特的“危险区”，特别是在弥漫型胃癌中，该区域基质和免疫细胞的聚集显著增加。对危险区内基质细胞与免疫细胞串扰的分析表明，CCDC80+成纤维细胞通过CXCL12-CXCR4轴诱导CD8+T细胞耗竭，从而导致局部肿瘤进展和免疫治疗抵抗。这一定义了胃癌进展和免疫抑制的关键空间特征，并为未来开发针对该空间互作环节的治疗策略（如靶向CCDC80+成纤维细胞或CXCL12–CXCR4轴）提供了理论基础。同时，研究构建的基于13基因的XGBoost分类器和基于H&E切片的LightGBM预测模型，为临床实现便捷、精准的危险区评估和患者风险分层提供了有力的工具。
