《Molecular Plant Pathology》：ZmWRKY92-Mediated miR169s/NF-YA13 Module Confers Maize Resistance to Bipolaris maydis by Activating Flavonoid Biosynthesis
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本研究系统揭示了ZmWRKY92–zma-miR169s–ZmNF-YA13–类黄酮（flavonoid）信号模块在玉米抗南方叶枯病（由Bipolaris maydis引起）中的核心调控机制。作者证实转录因子ZmWRKY92直接结合zma-miR169s启动子并抑制其转录，从而解除该microRNA对下游靶标ZmNF-YA13的负调控，进而激活类黄酮生物合成通路，促进没食子儿茶素（gallocatechin）、槲皮素（quercetin）等抗真菌化合物积累，最终增强玉米抗病性。该工作为通过遗传改良提升玉米抗病性提供了新的分子靶点。
ZmWRKY92与zma-miR169s/ZmNF-YA13模块的鉴定
microRNA（miRNA）是植物免疫反应的关键调节因子。先前研究发现，玉米中的zma-miR169s是防御南方叶枯病病原真菌Bipolaris maydis的负调控因子，但其上游调控和下游信号机制尚不清楚。本研究旨在阐明一个完整的抗病信号通路。
研究者首先利用生物信息学工具对zma-miR169s的启动子进行分析，预测了多个转录因子家族（包括WRKY）的潜在结合位点。在预测的候选WRKY转录因子中，ZmWRKY92在B. maydis侵染后表现出显著且持续的诱导表达模式，提示其在病原响应中可能发挥重要作用。酵母单杂交（Y1H）实验证实，ZmWRKY92能够结合到zma-miR169s启动子中的W-box顺式元件上。进一步的萤光素酶（LUC）报告基因实验表明，ZmWRKY92的过表达显著抑制了由zma-miR169s启动子驱动的报告基因活性，证明ZmWRKY92是zma-miR169s的转录抑制因子。电泳迁移率变动分析（EMSA）结果进一步验证了ZmWRKY92蛋白能够特异性地结合到含有野生型W-box元件的探针上，而当该基序突变后结合消失。这些结果共同表明，ZmWRKY92作为转录抑制因子，通过直接结合zma-miR169s的启动子来抑制其表达。
ZmWRKY92在玉米抗B. maydis中的功能验证
为了探究ZmWRKY92在抗病中的功能，研究团队创制了过表达ZmWRKY92的转基因玉米株系。与野生型相比，过表达株系中ZmWRKY92的转录水平显著升高，而zma-miR169s及其前体的表达水平则相应下降。接种B. maydis后，过表达株系表现出显著减弱的病害症状和更低的病情指数。对真菌生物量的定量分析也证实，过表达株系中病原菌的定殖量显著减少。相反，两个独立的Zmwrky92乙基甲磺酸（EMS）突变体则表现出对B. maydis的高度感病性，同时zma-miR169s及其前体的表达被诱导上调。这些结果表明，ZmWRKY92正向调控玉米对B. maydis的抗性。
下游靶标ZmNF-YA13的鉴定与功能分析
前期研究已证实ZmNF-YA13是zma-miR169s的直接靶标。本研究进一步对ZmNF-YA13进行了表征。亚细胞定位分析显示，ZmNF-YA13-GFP融合蛋白特异性定位于细胞核，表明其是一个核定位蛋白。组织特异性表达分析发现，ZmNF-YA13在玉米的根、叶、雄穗、雌穗、苞叶和花丝中均有表达，其中在雄穗和雌穗中表达最高，在叶中也有基础表达。更重要的是，在B. maydis侵染后，ZmNF-YA13的表达水平上调，在接种后48小时达到峰值，表明其在真菌侵染过程中被诱导。
基于ZmNF-YA13受zma-miR169s抑制，而其表达水平与ZmWRKY92活性相反，研究推测ZmNF-YA13是ZmWRKY92-miR169s模块在抗病中的下游组分。为了验证这一假设并明确其直接功能，研究团队创制了过表达ZmNF-YA13的转基因株系和利用CRISPR/Cas9技术敲除ZmNF-YA13的突变体。接种B. maydis后，过表达株系仅出现零星病斑，病情指数和真菌生物量均显著低于野生型。与之相反，两个敲除突变体则表现出加重的病害症状、更高的病情指数和显著增加的病原菌生物量。这证明ZmNF-YA13正向调控玉米对B. maydis的防御反应。
ZmNF-YA13通过激活类黄酮生物合成通路增强抗性
为了探究ZmNF-YA13调控植物防御的机制，研究者对野生型和ZmNF-YA13过表达（OE）玉米进行了整合转录组学和代谢组学分析。实验设置了四个处理组：未处理的野生型、未处理的OE、接种B. maydis的野生型（WT-B）和接种B. maydis的OE（OE-B）。
转录组学分析显示，ZmNF-YA13的过表达显著改变了玉米的转录组。即使在没有病原侵染的情况下，OE组相对于野生型也存在大量差异表达基因。在接种病原菌后，OE-B组同样表现出大量差异表达基因。代谢组学分析也得到了类似的结果，OE组和OE-B组相对于各自的对照组存在大量差异表达代谢物。通过韦恩图分析不同组间共有的差异表达基因和代谢物，并对其进行KEGG通路富集分析，发现类黄酮生物合成通路被显著富集。
对类黄酮通路中关键酶编码基因的表达模式和下游代谢物积累水平的分析显示，在过表达株系中，大部分注释为HCT、CHS、CHI、FLS和F3'H的基因表达上调，而4CL基因表达下调。相应地，下游多种类黄酮化合物，如樱花素（sakuranetin）、槲皮素、查尔酮（chalcone）、白矢车菊素（leucodelphinidin）和没食子儿茶素等均发生积累。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）对关键基因表达量的验证，以及高效液相色谱法（HPLC）对抗性相关类黄酮（槲皮素和没食子儿茶素）含量的测定，均证实了上述组学分析结果。此外，平板拮抗实验表明，在培养基中添加槲皮素和查尔酮能显著抑制B. maydis的菌丝生长，其中槲皮素的抑制率达到39.5%。这些协调一致的基因表达和代谢物丰度变化强有力地表明，ZmNF-YA13的过表达激活了类黄酮生物合成通路。
讨论与总结
南方玉米叶枯病是严重威胁全球玉米生产的毁灭性真菌病害。本研究揭示了一个全新的植物免疫调控机制：转录因子ZmWRKY92通过直接结合zma-miR169s的启动子，抑制其转录。这种抑制作用解除了zma-miR169s对其靶基因ZmNF-YA13的抑制，从而促进了ZmNF-YA13的积累。上调的ZmNF-YA13进而激活类黄酮生物合成通路，促进没食子儿茶素、槲皮素、查尔酮等具有抗真菌活性的类黄酮化合物的合成与积累，最终赋予玉米对B. maydis的抵抗能力。本研究的发现不仅阐明了一个连接转录调控和转录后调控的复杂信号网络，也为通过遗传工程靶向该WRKY–miRNA–NF-YA–类黄酮模块来改良玉米的抗病性提供了新的策略和分子靶点。
