《The Plant Journal》：SMXL3 controls multiple aspects of Arabidopsis development via EAR motif-dependent and -independent functions
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本研究通过双突变体和一系列回补系深入探索了拟南芥SMXL4超分支（包含SMXL3、SMXL4和SMXL5）的体内功能，揭示了这些蛋白在根系构型、地上部发育及胚胎发育中发挥的组合性、冗余性调控作用。研究发现，SMXL3的C端EAR抑制基序对维持根系结构（如主根优势、锚根抑制和根生长轨迹）至关重要，但其地上部功能（如营养生长、花序分枝和胚胎发育）则部分独立于EAR基序。SMXL4超分支成员可能通过调节生长素（auxin）的再分布或局部积累来协调发育进程，从而确立了SMXL蛋白作为依赖环境信号调控植物发育的关键组件。
SMXL4超分支成员在拟南芥发育中的组合功能与机制
SMXL（SUPPRESSOR OF MAX2 1-LIKE）蛋白是多功能抑制因子，在植物发育中扮演着多样化且部分冗余的角色。其中，与独脚金内酯（strigolactone）和列当内酯（karrikin）信号无关的SMXL4超分支（包括SMXL3、SMXL4和SMXL5）的功能尚未被充分探索。本研究发现，SMXL3通过其保守的EAR基序依赖性和非依赖性机制，协同SMXL4和SMXL5，广泛调控拟南芥的根系结构、地上部发育和胚胎形成。
保守结构域与SMXL3的EAR基序功能分析
通过AlphaFold3预测和序列比对，SMXL3具有与其他SMXL蛋白相似的结构域，但缺乏RGKT降解决定子基序。其C端包含一个保守的LDLNx型EAR基序。为探究SMXL3关键结构域的功能，研究团队在smxl3,5双突变体背景下构建了一系列YFP标记的缺失突变体进行回补实验。缺失N端Clp-N结构域（ΔClp-N）或D1区类DLN框基序（ΔD1）的构建体均无法回补smxl3,5的短主根表型，且ΔClp-N蛋白的稳定性受损。相比之下，缺失EAR基序（ΔEAR）或其丙氨酸替代突变体（ΔEARAla）的SMXL3蛋白仍能正常定位，并能部分回补短主根表型。有趣的是，在smxl3,4背景下，ΔEAR对主根表型的回补效果介于smxl3,5回补系与野生型之间，表明SMXL3 EAR基序的功能依赖于SMXL4和SMXL5的遗传背景，具有环境依赖性。
SMXL3与SMXL5以相反方式调控不定根形成
在光照下生长的smxl3,5幼苗下胚轴会自发形成大量不定根，这一表型可被生长素运输抑制剂NPA和独脚金内酯类似物rac-GR24抑制，暗示其依赖于生长素运输和独脚金内酯信号。然而，在黄化幼苗经光照诱导不定根形成的经典实验中，smxl3,5的不定根形成能力反而受到抑制。这种矛盾的表型表明，SMXL3/SMXL5组合在光照和暗处理下对不定根形成具有相反的调控作用。研究还发现，类胡萝卜素生物合成抑制剂norflurazon（NF）以及新型二脱辅基类胡萝卜素锚根烯（anchorene）能影响此过程，说明类胡萝卜素衍生信号也参与其中。SMXL3的EAR基序对不定根形成的抑制并非必需。
SMXL3的EAR基序是抑制锚根形成所必需的
锚根是发生在下胚轴-根连接处（根颈）的特化根。所有SMXL4超分支双突变体（smxl3,4、smxl3,5、smxl4,5）均表现出锚根形成增强，表明这三个成员冗余地抑制锚根发生。锚根形成同样依赖于生长素运输（NPA敏感），但对NF处理仅部分敏感。引人注目的是，SMXL3的EAR基序对于有效抑制锚根形成至关重要，因为ΔEAR构建体无法在双突变体中完全恢复野生型的锚根抑制表型。
SMXL3的EAR基序对维持主根顶端优势至关重要
双突变体表现出复杂多变的根系构型。到萌发后14天，所有双突变体的锚根或侧根长度都可与主根相当甚至超过主根，表明主根顶端优势丧失。ΔEAR构建体仅能部分恢复主根长度，且未能完全恢复主根相对于侧根/锚根的优势地位。此外，双突变体中首次出现的侧根位置异常靠近根颈（0.5毫米内），而ΔEAR系也未能完全纠正此缺陷。这些结果均指向SMXL3通过其EAR基序在维持正常主根生长和顶端优势中发挥关键作用。
SMXL3的EAR基序是建立正常根生长轨迹所必需的
smxl3,5和smxl4,5突变体的主根表现出波浪式生长轨迹，垂直生长比下降。ΔEAR系，尤其是在smxl3,5背景下，表现出更严重的向地性缺陷，根生长轨迹更加弯曲。遗传学实验证实ΔEAR是隐性功能缺失突变。利用荧光标记的生长素类似物FluorA II.进行检测发现，在发生向地性缺陷的smxl3,5和ΔEAR根系中，根尖的生长素分布发生紊乱。NPA处理加剧了ΔEAR系的根卷曲，而NF处理可部分挽救其笔直生长，再次暗示类胡萝卜素衍生信号参与根轨迹调控。因此，SMXL3的EAR基序通过影响生长素分布，对维持正常的根向地性生长至关重要。
SMXL4超分支成员协同调控营养生长与分枝结构
与根系表型不同，SMXL3的地上部功能很大程度上不依赖其EAR基序。所有双突变体在长日照下均表现出莲座面积减小、开花时间延迟、花青素积累增加以及到达初级花序停滞期的时间推迟。其中，smxl3,5发育最为迟缓。在分枝方面，smxl4,5的初级分枝数略有减少，而smxl3,4则表现出显著增多的三级分枝，且该表型可被ΔEAR构建体回补，说明SMXL3和SMXL4共同抑制高级别分枝，且不依赖SMXL3的EAR基序。将ΔEAR构建体导入smxl3,4,5三突变背景（本为幼苗致死）中，植株仍表现出严重的发育缺陷，证实SMXL3在缺少SMXL4和SMXL5时，其完整功能（包括EAR基序）是必需的。
SMXL3与SMXL4共同促进角果和胚胎发育
smxl3,4植株的角果更短，且含有更多发育迟缓或败育的种子。胚胎表达分析显示，SMXL3、SMXL4和SMXL5均在鱼雷期胚胎的维管组织中强烈表达。对smxl3,4角果的胚胎进行观察，发现了处于球形期、心形期、鱼雷期等不同发育阶段的胚胎，而野生型种子中胚胎已处于成熟绿色阶段，表明胚胎发育进程被延迟。SMXL3的ΔEAR构建体能完全回补smxl3,4的种子发育缺陷，说明SMXL3在此过程中不依赖EAR基序。正反杂交实验证实种子减少并非受精缺陷所致，而是胚胎发育本身的问题。
讨论：SMXL4超分支成员以组合方式并通过EAR依赖/非依赖机制调控发育
本研究表明，SMXL4超分支成员在调控拟南芥多个发育过程中展现出高度的冗余性和组合特异性。它们可能通过形成蛋白互作复合体、作为转录因子直接结合DNA或调节并行转录网络来发挥作用。在根系中，SMXL3的功能强烈依赖其EAR基序，这可能涉及通过招募TPL/TPR等共抑制因子来调控生长素依赖的基因表达，从而影响生长素再分布、维持主根优势、抑制锚根形成和保证正常根轨迹。在地上部和胚胎发育中，SMXL3的功能则主要通过不依赖EAR基序的机制实现，可能涉及蛋白质互作等转录非依赖途径。研究结果最终揭示了SMXL蛋白作为关键调控枢纽，通过整合转录与非转录机制，以环境依赖的方式精细协调植物发育。
