《Small Structures》：Dual-Functional 3D-Printed Porous Titanium–Hydrogel Composite Scaffold With Mg2+ and ZIF-8 Release for Enhanced Bone Regeneration and Bacterial Inhibition
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本研究针对3D打印钛植入体的生物惰性与抗菌缺陷，创新性地构建了一种聚多巴胺（PDA）涂层增强结合力的多孔钛-水凝胶复合支架。该支架通过整合负载镁离子（Mg2+）与沸石咪唑酯框架-8（ZIF-8）的季铵化壳聚糖（QCS）/醛基封端泊洛沙姆F127（PF127-CHO）水凝胶，实现了Mg2+与Zn2+的缓控释。体外与体内实验证实，该复合支架具有良好的生物相容性，可协同促进成骨细胞（MC3T3-E1）的粘附、增殖与成骨分化，并有效抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）和大肠杆菌（E. coli）生长，为同步解决骨科植入体无菌性松动（AL）与植入体相关感染（IAI）难题提供了有前景的策略。
文章内容总结
引言
骨缺损的修复是创伤、感染或肿瘤切除术后临床面临的重要挑战。3D打印钛植入体因其良好的生物相容性、耐腐蚀性和生物力学性能而在骨重建领域得到广泛应用。然而，钛本身的生物惰性限制了其在骨-植入体界面诱导骨整合的能力，且缺乏抗菌性能。这两个弱点可导致无菌性松动（AL）和植入体相关感染（IAI）——这是植入体失败的两个主要原因。因此，开发兼具优异成骨和抗菌活性的改性钛植入体具有重要的临床意义。
镁离子（Mg2+）等生物活性金属离子在促进成骨分化和加速骨再生方面显示出巨大潜力，但传统方法将其掺入钛植入体常导致突释甚至过量，产生不良反应。因此，迫切需要一种能够确保镁离子稳定释放的控释系统。
同时，抗菌能力对于预防IAI至关重要。IAI通常始于细菌粘附，随后是细菌增殖和生物膜形成。生物膜充当细菌的保护盾，使其难以被宿主免疫系统甚至抗生素清除。尽管抗生素常用，但抗生素耐药性的兴起凸显了对替代策略的需求。金属-有机框架（MOFs）是一类由金属离子和有机配体组成的多功能材料。沸石咪唑酯框架-8（ZIF-8）是MOFs的一种亚型，由锌离子（Zn2+）和2-甲基咪唑组成。ZIF-8具有良好的生物相容性，在降解过程中可释放具有抗菌特性的Zn2+和2-甲基咪唑，并且也被报道可促进骨再生，适合用于修饰钛植入体。然而，将ZIF-8有效且稳定地负载到钛植入体上仍是一个挑战。
水凝胶是一种具有三维网络结构的聚合物材料，可促进细胞粘附、增殖和分化，具有良好的生物相容性和生物降解性，越来越多地被用作各种治疗剂（如抗生素、生物活性离子和能够调节骨代谢活性的分子）的递送平台。在先前的研究中，团队设计了一种具有良好生物相容性、粘附性和抗菌能力的季铵化壳聚糖（QCS）/醛基封端泊洛沙姆F127（PF127-CHO）水凝胶，可作为治疗剂的载体并抑制细菌生长。然而，QCS/PF127-CHO（QP）水凝胶的机械性能限制了其在承重组织中的应用。
为了同时解决上述问题，本研究开发了一种创新的复合支架，由3D打印多孔钛支架和负载Mg2+与ZIF-8的QP水凝胶组成。在该复合支架中，Mg2+和ZIF-8被期望能增强钛的成骨活性，而QP水凝胶和ZIF-8则作为抗菌剂。为了增强钛-水凝胶界面的结合强度，在钛表面涂覆了聚多巴胺（PDA）。本研究评估了该复合支架的理化性能、生物相容性、体外成骨活性和抗菌性能，并利用两种动物模型验证了其体内成骨和抗菌能力。
实验部分
材料与合成
研究所用化学试剂包括壳聚糖、2-甲基咪唑、Zn(NO3)2·6H2O、多巴胺盐酸盐、季铵化试剂（GTMAC）、Pluronic F127（PF127）、对羟基苯甲醛和MgCl2·6H2O等。季铵化壳聚糖（QCS）的合成是通过在酸性环境下将GTMAC接枝到壳聚糖骨架上完成的。PF127-CHO的合成涉及两步：首先，PF127与甲磺酰氯反应生成两端带有甲磺酸酯基的PF127-SO3；随后，对羟基苯甲醛取代PF127-SO3两端的甲磺酸酯基，生成苯甲醛封端的PF127-CHO。ZIF-8是通过Zn(NO3)2·6H2O和2-甲基咪唑在甲醇中快速自组装制备的。
支架制备
通过选择性激光熔化（SLM）技术制造3D打印多孔钛支架，孔径设计为600微米，孔隙率约为60%。将多巴胺盐酸盐溶解在Tris-HCl缓冲液中，将钛支架浸泡并搅拌，在其表面形成PDA涂层，得到pTi。QP、QPM（负载Mg2+）和QPMZ（负载Mg2+和ZIF-8）水凝胶是通过混合QCS溶液和PF127-CHO溶液（对于QPM和QPMZ，PF127-CHO溶液中预先溶解了MgCl2·6H2O，QPMZ中还分散了ZIF-8），在37°C下形成交联网络。复合支架的制备是通过将pTi完全浸入相应的水凝胶前体溶液中，离心使其充分渗透到支架孔隙中，然后在37°C下凝胶化，最终得到QP-Ti、QPM-Ti和QPMZ-Ti。
表征
通过核磁共振氢谱（1H NMR）和傅里叶变换红外光谱（FT-IR）验证了QCS和PF127-CHO的成功合成。扫描电子显微镜（SEM）观察显示ZIF-8呈菱形十二面体形状，粒径分布均匀（约258.6纳米）。X射线衍射（XRD）证实了ZIF-8的晶体结构。QP、QPM和QPMZ水凝胶均具有互连的多孔结构，加入Mg2+显著减小了水凝胶的孔径。能量色散X射线光谱（EDS）元素映射显示，在QPM和QPMZ水凝胶中，Mg和Zn元素均匀分布。流变学测试表明，三种水凝胶均具有良好的自愈合性能，归因于动态的席夫碱键。降解测试显示水凝胶可逐渐降解。电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP-AES）测定表明，QPMZ水凝胶中的Mg2+和Zn2+在超过30天的时间内实现了持续可控的释放，而非突释。
微计算机断层扫描（Micro-CT）测定钛支架的孔径约为585.74微米，孔隙率约为61.57%，符合理想骨科多孔植入体的要求。压缩测试表明，QPMZ水凝胶的负载对钛支架的压缩强度和弹性模量没有显著影响。搭接剪切测试证明，PDA涂层能显著增强钛-水凝胶界面的结合强度（化学键合组高于物理键合组）。SEM观察也显示，PDA涂层组的界面无明显间隙，结合更紧密。Zeta电位测试表明，QPMZ-Ti具有最低的绝对Zeta电位值，这可能更有利于蛋白质吸附和细胞粘附。
细胞实验
使用小鼠前成骨细胞系MC3T3-E1进行评估。流式细胞术和活/死染色结果表明，所有支架（Ti、QP-Ti、QPM-Ti、QPMZ-Ti）均未明显增加细胞凋亡，表现出良好的生物相容性。CCK-8细胞增殖实验显示，培养第4天和第7天，QPM-Ti和QPMZ-Ti组的细胞增殖水平显著高于Ti和QP-Ti组，且QPMZ-Ti组最高，表明Mg2+和ZIF-8具有协同促进细胞增殖的作用。SEM观察和免疫荧光染色（F-肌动蛋白和纽蛋白Vinculin）结果显示，与Ti和QP-Ti组相比，QPM-Ti和QPMZ-Ti组细胞铺展更充分，具有更多板状伪足，纽蛋白表达量更高，其中QPMZ-Ti组表现最佳，表明Mg2+和ZIF-8协同促进了细胞粘附。
体外成骨活性
通过茜素红S（ARS）染色和碱性磷酸酶（ALP）染色评估成骨分化。培养14天和21天后，QPM-Ti和QPMZ-Ti组细胞外基质（ECM）中钙结节沉积显著多于Ti和QP-Ti组，且QPMZ-Ti组最多。培养3天和7天后，ALP活性显示相同趋势。免疫荧光染色显示，RUNX2（一种关键的成骨转录因子）在QPM-Ti和QPMZ-Ti组的表达水平更高，QPMZ-Ti组最高。实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）进一步证实，在培养7天和14天后，QPM-Ti和QPMZ-Ti组成骨相关基因（Runx2、骨桥蛋白Opn、骨钙素Ocn、Osterix）的表达水平显著上调，且QPMZ-Ti组的表达水平在所有组中最高。这些结果一致表明，从水凝胶中持续释放的Mg2+和从ZIF-8降解中释放的Zn2+产生了协同效应，共同促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化。
体内成骨活性
在兔股骨髁缺损模型中植入支架4、8、12周后，通过Micro-CT和范吉森（VG）染色评估。3D重建和定量分析（骨体积分数BV/TV、骨小梁分离度Tb.Sp、骨小梁数量Tb.N）显示，随着时间的推移，所有组的新骨形成均增加，但QPM-Ti和QPMZ-Ti组的新骨形成量始终显著高于Ti和QP-Ti组，且QPMZ-Ti组在各个时间点都表现最佳。VG染色结果与Micro-CT分析一致，显示QPMZ-Ti组支架孔隙内的新骨长入最多。这表明Mg2+和ZIF-8的协同作用显著促进了体内骨再生。除了直接影响成骨细胞，释放的Mg2+和Zn2+还可能通过调节巨噬细胞向M2表型极化，为成骨分化提供有利的免疫微环境。
体外抗菌活性
针对金黄色葡萄球菌（S. aureus，革兰氏阳性）和大肠杆菌（E. coli，革兰氏阴性）进行测试。平板涂布法计数显示，培养24小时和48小时后，QPMZ-Ti组的菌落形成单位（CFUs）最少。抗菌率计算表明，QP-Ti和QPM-Ti组的抗菌率无显著差异（说明Mg2+本身抗菌作用不显著），但QPMZ-Ti组的抗菌率显著高于前两者，证明QP水凝胶和ZIF-8具有协同抗菌作用。QP水凝胶的抗菌性主要源于带正电的QCS通过静电吸附破坏细菌细胞壁，以及席夫碱结构（─N═CH─）的抑菌作用。ZIF-8的抗菌机制则涉及降解释放的Zn2+（破坏细胞壁、产生活性氧ROS、干扰酶活性）和2-甲基咪唑（产生活性氧、破坏膜完整性）。
结晶紫染色定量评估抗生物膜效果，QPMZ-Ti组在570纳米处的吸光度值显著低于其他组，表明其能有效抑制生物膜形成。QCS可通过干扰群体感应来抑制生物膜，而ZIF-8可通过抑制细菌粘附和阻断精氨酸生物合成途径来破坏生物膜。SEM观察直接显示，在Ti表面有大量形态完整的细菌和生物膜，而在QP-Ti、QPM-Ti和QPMZ-Ti表面，细菌数量锐减，细胞壁破损，可见死菌，且几乎无生物膜形成。
体内抗菌活性
在大鼠皮下感染模型中评估。植入7天和14天后，对支架周围组织进行苏木精-伊红（H&E）染色。结果显示，Ti组周围有大量炎性细胞浸润，感染严重；QP-Ti和QPM-Ti组的炎症较轻；而QPMZ-Ti组的炎性细胞最少，感染程度最轻。这表明复合支架，特别是QPMZ-Ti，在体内也能有效抑制细菌生长、减轻局部炎症反应，与体外实验结果一致。
结论
本研究成功开发了一种双重功能的3D打印多孔钛-水凝胶复合支架。通过PDA涂层增强了界面结合力，并通过QP水凝胶实现了Mg2+和ZIF-8的缓控释。该复合支架具有良好的生物相容性，能协同促进成骨细胞的粘附、增殖与分化，并对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出优异的抗菌和抗生物膜活性。体内实验进一步证实了其显著促进骨再生和有效抑制细菌感染的能力。这项工作为同时优化钛植入体的成骨和抗菌性能，以应对临床中无菌性松动和植入体相关感染的挑战，提供了一种简便有效的策略。
