《Small Structures》：Scutellaria Baicalensis-Derived Carbon Dots Alleviate Colitis by Activating Anti-Inflammatory and Barrier-Protective Cascades
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本研究以传统中药黄芩为前体，创新性地合成了三种碳点(Carb-CDs, Micro-CDs, Hydro-CDs)，其中水热法合成的Hydro-CDs展现出卓越的抗氧化(SOD样活性)、抗炎及生物相容性。在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，Hydro-CDs可靶向富集于炎症结肠，通过调控cAMP、钙离子及cGMP-PKG等关键信号通路，有效抑制炎症因子分泌、上调紧密连接蛋白表达、恢复异常血液参数，从而显著缓解疾病症状。该工作首次报道了黄芩源碳点的合成，为炎症性肠病(IBD)的靶向纳米治疗提供了创新性协同策略。
1 引言
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性炎症性肠病(IBD)，其特征是持续的黏膜损伤、氧化应激和免疫反应失调。现有疗法存在疗效有限和全身性副作用等问题，因此需要更安全、靶向的替代方案。碳点(CDs)作为一种多功能纳米平台，因其优异的生物相容性和可定制的生物活性而受到青睐。受传统中药黄芩抗炎和抗氧化特性的启发，本研究开发了草药衍生的碳点用于靶向UC治疗。
碳点是一类尺寸通常低于10 nm的准球形碳基纳米材料，自2004年被偶然发现以来，已成为纳米技术领域的新星。其合成策略主要分为“自上而下”和“自下而上”两类方法。水热法因能精确控制碳点尺寸、荧光等特性而备受青睐。黄芩作为传统中药，其生物活性黄酮类成分(如黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素)具有显著的抗炎和抗氧化作用，在UC管理中显示出改善肠道屏障完整性、调节肠道菌群、减轻黏膜炎症和氧化应激的潜力。
基于黄芩的内在特性和碳点的设计原理，本研究预期黄芩源碳点在UC治疗中能展现出集成的结构和功能优势。
2 结果与讨论
2.1 Carb-CDs、Micro-CDs和Hydro-CDs的制备与表征
本研究以黄芩为前体，通过三种不同的方法合成了碳点：碳化法(Carb-CDs)、微波法(Micro-CDs)和水热法(Hydro-CDs)。透射电镜(TEM)图像显示所有三种碳点均分散良好，呈准球形。统计分析得出平均粒径为：Carb-CDs 1.66 ± 0.35 nm，Micro-CDs 2.27 ± 0.37 nm，Hydro-CDs 1.39 ± 0.34 nm。高分辨TEM进一步证实了晶格条纹的存在。Zeta电位测量值为：Carb-CDs -12.33 ± 0.58 mV，Micro-CDs -16.47 ± 0.72 mV，Hydro-CDs -32.35 ± 0.92 mV，表明Hydro-CDs具有最高的表面电荷和胶体稳定性。X射线衍射(XRD)分析显示宽峰，表明结构主要为非晶态。紫外-可见吸收光谱显示Hydro-CDs和Micro-CDs在280–290 nm处有特征吸收峰，归因于芳香C=C键的π–π*跃迁，而Carb-CDs的吸收谱则相对平淡。荧光特性分析表明，Hydro-CDs在370 nm激发下发射强度最高，显示出优越的光学性能。傅里叶变换红外光谱(FTIR)显示三种碳点具有相似的官能团。X射线光电子能谱(XPS)详细分析了碳点的表面化学状态和组成，证实了碳、氮、氧元素的存在以及各种极性官能团(如羰基、羧基、羟基和氨基)的存在。综合表征表明，虽然三种碳点具有共同的结构特征，但在粒径、表面电荷、光学性质和官能团组成上存在明显差异，这些差异与其各自的合成方法内在相关。其中，Hydro-CDs表现出更优的光学性能和表面功能，可能增强其生物医学应用潜力。
2.2 Carb-CDs、Micro-CDs和Hydro-CDs的抗氧化能力评估
通过多种自由基清除实验系统评估了合成碳点的抗氧化能力。ABTS+·自由基清除实验显示，所有三类碳点均表现出剂量依赖性的清除效果。在200 μg/mL浓度下，Micro-CDs和Hydro-CDs的清除率超过90%，Carb-CDs略低，为88%。超氧阴离子自由基(·O2?)清除实验显示，在200 μg/mL时，Carb-CDs、Micro-CDs和Hydro-CDs的清除效率分别为54.2%、64.8%和66.7%。羟基自由基(·OH)清除实验显示，在相同浓度下，三者的清除率分别为67.2%、81.5%和85.4%。电子顺磁共振(EPR)光谱进一步验证了碳点对·O2?和·OH的清除能力，其中50 μg/mL的Hydro-CDs在三种碳点中显示出最显著的清除效果。此外，超氧化物歧化酶(SOD)模拟活性评估显示，Hydro-CDs的酶样活性最高(177.683 U/mL)，其次是Micro-CDs (114.626 U/mL)和Carb-CDs (29.016 U/mL)。总之，Carb-CDs、Micro-CDs和Hydro-CDs均表现出针对ABTS+·、·O2?和·OH的浓度依赖性抗氧化活性。其中，Hydro-CDs consistently表现出最强的自由基清除能力和最高的SOD模拟活性，表明其作为抗氧化剂的优越潜力。
Hydro-CDs增强的抗氧化性能可归因于其高度共轭的碳核、优化的石墨有序性以及丰富的表面官能团(特别是氮和氧物种)的协同组合，这些特性共同增强了电子的供给能力并稳定了自由基中间体。
2.3 Carb-CDs、Micro-CDs和Hydro-CDs的体外功能评价
在RAW264.7巨噬细胞中，Cy5标记的碳点的细胞摄取效率在12小时内呈时间依赖性增加。12小时后，近99.5%的Hydro-CDs被内化，而Carb-CDs和Micro-CDs的摄取率分别为91.4%和92.1%。在400 μM H2O2诱导的氧化应激下，细胞内·O2?和活性氧(ROS)水平检测显示，H2O2处理显著增加了细胞内·O2?和ROS水平，而所有三种碳点都表现出显著的清除作用。用Hydro-CDs预处理导致·O2?和ROS水平最显著的降低。qRT-PCR分析显示，脂多糖(LPS)刺激显著上调了炎症因子的mRNA表达，而用碳点特别是Hydro-CDs预孵育则显著抑制了这种LPS诱导的细胞因子表达。此外，碳点对LPS诱导的巨噬细胞向促炎M1表型极化的抑制评估显示，Hydro-CDs预处理将M1极化率显著降低至10.3%，而Carb-CDs和Micro-CDs的抑制作用较为温和。这些结果表明，所有碳点都具有抗炎特性，其中Hydro-CDs在调节RAW264.7巨噬细胞的炎症反应方面表现出最强的功效。
在人结肠上皮细胞NCM460中，细胞摄取实验显示12小时后Hydro-CDs的内化率最高(95%)。在H2O2诱导的氧化应激下，荧光成像和流式细胞术检测显示，Hydro-CDs预处理能最有效地抑制ROS水平的升高，其保护作用最为显著。这些结果证明，所有三种碳点都能有效缓解NCM460细胞中H2O2诱导的ROS积累，其中Hydro-CDs显示出最强的保护作用。
2.4 生物相容性评价
在RAW264.7和NCM460细胞中，通过MTT法评估了碳点的细胞毒性。结果显示，即使在最高浓度(100 μg/mL)下，Hydro-CDs和Micro-CDs在RAW264.7细胞中仍能保持细胞活力在100%以上。相比之下，Carb-CDs在RAW264.7细胞中引起浓度依赖性的活力下降。在NCM460细胞中，Hydro-CDs表现出优异的生物相容性，而Carb-CDs在较高浓度下表现出明显的细胞毒性。基于Hydro-CDs优越的细胞安全性，我们进一步评估了其全身生物安全性。溶血实验表明，Hydro-CDs在所有测试浓度下溶血率均低于5%，具有良好的血液相容性。对C57BL/6小鼠连续7天腹腔注射Hydro-CDs (20 mg/kg)后，体重监测、主要器官的组织病理学检查(H&E染色)、血液学分析和血液生化指标检测均未发现明显的全身毒性、组织病理学异常或血液学改变。这些结果共同证实Hydro-CDs具有良好的生物安全性，支持其进一步的生物医学应用。
2.5 Hydro-CDs的生物分布
Cy5.5标记的Hydro-CDs在小鼠腹腔注射后的生物分布和器官积累通过活体成像系统进行追踪。荧光信号显示，Hydro-CDs在给药后迅速全身分布，并随时间逐渐在腹部器官积累。离体成像显示，荧光显著积累在肝脏、肾脏和肺部，其次是脾脏，而心脏信号相对较低。在胃肠道(包括结肠)也观察到明显的荧光，且在整个观察期内结肠区域的荧光强度在30分钟时显著高于肾脏。值得注意的是，在6小时时间点，UC小鼠结肠的相对荧光强度显著高于健康对照组。这些结果表明，胃肠道是Hydro-CDs的主要代谢途径，并且在DSS诱导的UC模型中，Hydro-CDs表现出更明显的结肠特异性积累。这种积累可能通过腹膜直接吸收、门静脉循环介导的全身再分布以及肝胆排泄等多种机制实现，突出了Hydro-CDs作为肠道疾病治疗剂的强大潜力。
2.6 Hydro-CDs对UC的治疗效果
在DSS诱导的急性结肠炎小鼠模型中，评估了Hydro-CDs的治疗潜力。与DSS模型组相比，Hydro-CDs治疗显著减轻了体重下降，降低了疾病活动指数(DAI)评分，并显著保留了结肠长度。结肠组织的H&E染色显示，Hydro-CDs治疗改善了黏膜损伤、隐窝丢失和炎症浸润等病理变化。免疫荧光分析显示，Hydro-CDs治疗显著保留了紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-1的表达和膜定位，表明肠道屏障完整性得到增强。qRT-PCR分析显示，Hydro-CDs治疗显著下调了结肠组织中促炎细胞因子IL-6和IL-1β的mRNA表达水平。全血细胞计数分析显示，Hydro-CDs治疗显著恢复了因DSS攻击而改变的血液学参数。累积证据表明，Hydro-CDs通过抑制关键促炎通路、恢复上皮屏障完整性以及调节系统性免疫反应等多种机制，显著缓解了UC的临床症状和结肠病理，凸显了其作为UC治疗剂的巨大潜力。
与粗提物相比，Hydro-CDs不仅保留了抗炎和抗氧化的生物活性部分，而且克服了草药溶解度差、生物利用度低和化学不稳定性等关键限制。更重要的是，Hydro-CDs的纳米结构使其能够通过增强渗透和滞留(EPR)效应优先积累在发炎的结肠组织中，这是游离提取物无法实现的靶向能力。
2.7 通过RNA测序探索Hydro-CDs对UC的作用机制
对结肠组织进行转录组分析，以揭示Hydro-CDs治疗所调控的关键生物学通路和基因网络。在Hydro-CDs治疗组与DSS组之间共鉴定出464个差异表达基因(DEGs)，包括408个显著上调和56个显著下调的基因。主成分分析(PCA)显示，三组实验样本的转录组存在清晰分离，Hydro-CDs治疗组样本位于DSS组和对照组之间的中间位置，表明Hydro-CDs部分地将DSS诱导的结肠炎小鼠的转录组谱恢复至更健康的状态。
KEGG富集分析揭示了Hydro-CDs治疗的潜在作用机制。在环境信息处理类别中，实验结果表明Hydro-CDs治疗调控了多个关键信号通路，包括cAMP信号通路、钙信号通路和cGMP-PKG信号通路，这些通路在基因富集数量和强度上均占据中心地位。基因集富集分析(GSEA)进一步证实了这些通路的协同激活。具体而言，与DSS组相比，Hydro-CDs治疗组中“cAMP信号通路”、“钙离子转运”和“cGMP介导的信号传导”均显示出显著的正富集分数。
深入分析表明，在cAMP信号通路中，Hydro-CDs治疗上调了Adcy1/5等基因的表达，这些基因编码腺苷酸环化酶，催化cAMP产生。细胞内cAMP水平的升高可抑制NF-κB活化，从而抑制TNF-α和IL-6等促炎细胞因子的释放。在钙信号通路中，Hydro-CDs治疗改变了Ryr3、Casq2和Mylk等基因的表达，这些基因调节细胞内钙稳态，对维持肠道屏障功能至关重要。通过恢复生理钙动态，Hydro-CDs促进了紧密连接的稳定性。在cGMP-PKG信号通路中，Prkg1等关键基因被调控。cGMP激活PKG，通过抑制促炎介质的磷酸化发挥抗炎作用。总之，Hydro-CDs通过协同激活cAMP、钙和cGMP-PKG信号通路来缓解UC病理，这种多通路激活同时抑制了炎症反应，并促进了肠道屏障的结构和功能恢复。
3 结论
本研究首次报道了黄芩源碳点的合成，并在小鼠UC模型中验证了其显著的治疗潜力。通过对碳化、微波和水热三种合成方法的系统比较，我们发现Hydro-CDs相比Carb-CDs和Micro-CDs表现出更优的生物活性，具体包括增强的ROS清除能力、优越的SOD样酶活性和更强大的抗炎作用。优化后的水热法成功制备的黄芩源Hydro-CDs不仅保留了原料草药的固有抗氧化和抗炎特性，而且表现出更好的生物相容性和结肠特异性靶向能力。在DSS诱导的急性UC小鼠模型中，Hydro-CDs的卓越治疗效果得到了充分验证：它通过多模式机制有效缓解了结肠炎症，包括抑制关键促炎通路、恢复上皮屏障完整性以及调节关键信号级联反应(如cAMP、钙和cGMP-PKG)。这项工作为天然药物启发的纳米材料合成建立了一种新策略，并凸显了水热法衍生的草药碳点作为下一代IBD靶向疗法的巨大潜力。
