《Journal of Diabetes Investigation》：LIN28A blocks the EndMT process of high glucose-induced HRMECs by stabilizing SIRT6 mRNA
编辑推荐：
本研究发现，在糖尿病视网膜病变(DR)中，高糖(HG)可诱导人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)发生内皮-间质转化(EndMT)。RNA结合蛋白LIN28A通过直接结合并稳定SIRT6的mRNA，上调SIRT6蛋白表达，进而激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号通路，从而有效抑制HG诱导的EndMT进程。该研究揭示了LIN28A/SIRT6/AMPK轴在DR中调控EndMT的新机制，为DR的靶向治疗提供了潜在的新策略。
文章内容
摘要
糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病(DM)一种严重的微血管并发症，是导致工作年龄成人视力丧失的主要原因之一。高血糖会破坏稳态调节，诱导内皮细胞功能障碍。其中，内皮-间质转化(EndMT)是一个关键病理过程，内皮细胞在此过程中失去其标志物(如PECAM1、CDH5)，获得间质细胞标志物(如α-SMA、S100A4)，并增强迁移能力，从而参与DR的发生发展。因此，深入探究DR中EndMT的调控机制对于寻找新的治疗靶点至关重要。本研究旨在探讨RNA结合蛋白Lin-28同源物A (LIN28A) 和人去乙酰化酶Sirtuin 6 (SIRT6) 在高糖(HG)诱导的人视网膜微血管内皮细胞(HRMECs)EndMT中的作用及其分子机制。
背景
SIRT6是一种NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶，在葡萄糖代谢和炎症稳态调控中发挥重要作用。已有临床研究表明，DR患者中SIRT6表达下调。同时，SIRT6被报道可通过激活AMP活化蛋白激酶(AMPK)信号通路来抑制EndMT。另一方面，LIN28A是一种RNA结合蛋白(RBP)，可通过调节靶mRNA的稳定性影响基因表达。通过数据库预测，我们发现LIN28A可能是SIRT6 mRNA的潜在结合蛋白。因此，我们提出假设：LIN28A可能通过稳定SIRT6 mRNA来上调SIRT6表达，进而激活AMPK信号通路，从而抑制高糖诱导的HRMECs发生EndMT。
结果
1. 高糖诱导HRMECs发生EndMT，并下调SIRT6表达
首先，研究团队用25 mmol/L D-葡萄糖处理HRMECs 48小时，成功构建了体外DR模型。Transwell实验结果显示，HG显著促进了HRMECs的迁移能力。在分子水平上，HG处理导致间质细胞标志物S100A4和α-SMA的mRNA和蛋白水平显著上调，而内皮细胞标志物PECAM1和CDH5的表达则显著下调。免疫荧光染色结果进一步证实，HG处理使细胞中α-SMA蛋白表达增加，PECAM1蛋白表达减少。这些结果表明，HG成功诱导了HRMECs发生EndMT。与此同时，研究者发现，在HG处理的HRMECs中，SIRT6在mRNA和蛋白水平的表达均显著降低。
2. 过表达SIRT6可抑制HG诱导的HRMECs EndMT
为了验证SIRT6的功能，研究者通过慢病毒感染技术在HRMECs中过表达了SIRT6 (oe-SIRT6)。Western blot和RT-qPCR证实过表达成功。功能实验表明，过表达SIRT6能有效逆转HG对HRMECs迁移能力的促进作用。同时，SIRT6的过表达也逆转了HG对EndMT相关标志物的影响：它下调了S100A4和α-SMA的表达，并上调了PECAM1和CDH5的表达。免疫荧光结果同样显示，SIRT6过表达降低了HG诱导的α-SMA升高和PECAM1降低。这些结果共同证明，SIRT6能够抑制HG诱导的HRMECs EndMT进程。
3. SIRT6通过激活AMPK信号通路抑制EndMT
接下来，研究探讨了SIRT6的作用机制。Western blot检测显示，HG处理降低了HRMECs中磷酸化AMPK (p-AMPK) 与总AMPK的比值，而SIRT6的过表达则能够恢复这一比值，表明SIRT6激活了AMPK信号通路。为了确认AMPK通路在此过程中的关键作用，研究使用了AMPK抑制剂Compound C。结果显示，Compound C处理能够抵消SIRT6过表达对p-AMPK/AMPK比值的上调作用。更重要的是，功能挽救实验表明，当用Compound C抑制AMPK活性后，SIRT6过表达对HG诱导的细胞迁移增强、EndMT标志物异常表达的抑制作用均被逆转。同样，利用小干扰RNA (siRNA) 敲低AMPK也得到了类似的结果。这些数据清晰地表明，SIRT6是通过激活AMPK信号通路来发挥其抑制EndMT的作用的。
4. LIN28A通过结合并稳定SIRT6 mRNA来上调SIRT6表达
机制研究的另一部分聚焦于SIRT6的上游调控因子。mRNA稳定性实验显示，HG处理降低了SIRT6 mRNA的稳定性。通过POSTAR数据库预测，研究者发现RNA结合蛋白LIN28A可能是SIRT6 mRNA的相互作用蛋白。随后的RNA免疫共沉淀(RIP)实验证实，在HRMECs中，LIN28A蛋白确实能够与SIRT6 mRNA结合，并且这种结合在高糖环境下减弱。RNA pull-down实验进一步从生化角度验证了LIN28A蛋白与SIRT6 mRNA的直接相互作用。功能上，在HRMECs中过表达LIN28A可上调SIRT6的表达，而敲低LIN28A则下调SIRT6表达。更重要的是，mRNA稳定性实验证明，LIN28A的过表达能够增强SIRT6 mRNA的稳定性，而其敲低则会降低SIRT6 mRNA的稳定性。即使在HG条件下，过表达LIN28A也能增强SIRT6 mRNA的稳定性。这些结果说明，LIN28A通过直接结合SIRT6 mRNA并增强其稳定性，从而在翻译水平上上调SIRT6蛋白的表达。
5. LIN28A通过上调SIRT6抑制HG诱导的HRMECs EndMT
最后，研究通过功能挽救实验验证了LIN28A/SIRT6轴在调控EndMT中的核心作用。在HG诱导的HRMECs中，过表达LIN28A (oe-LIN28A) 能够上调SIRT6表达，并抑制细胞迁移和EndMT标志物的异常变化（即降低α-SMA、S100A4，升高PECAM1、CDH5）。然而，当同时敲低SIRT6 (si-SIRT6) 时，LIN28A过表达带来的这些保护效应被完全逆转。免疫荧光染色结果也一致显示，LIN28A过表达能逆转HG引起的α-SMA升高和PECAM1降低，而SIRT6敲低则抵消了这一作用。此外，对公共数据集GSE20886 (链脲佐菌素诱导的DR大鼠模型) 的生物信息学分析显示，DR模型视网膜组织中LIN28A的表达显著下调，SIRT6的表达也呈下降趋势（虽未达统计学显著性）。这在一定程度上支持了本研究的细胞模型发现。
结论与讨论
综上所述，本研究揭示了在糖尿病视网膜病变背景下，高糖通过下调LIN28A表达，削弱了其对SIRT6 mRNA的稳定作用，导致SIRT6表达下降。SIRT6的减少进而抑制了AMPK信号通路的激活，最终促进了人视网膜微血管内皮细胞发生内皮-间质转化。这一“LIN28A/SIRT6/AMPK”调控轴的发现，为理解DR中微血管功能障碍的分子机制提供了新的视角。LIN28A作为SIRT6 mRNA稳定性的正向调节因子，以及SIRT6-AMPK轴作为EndMT的关键抑制通路，可能成为未来干预DR进展的潜在治疗靶点。当然，本研究主要基于体外细胞模型，未来需要在动物模型中进行更深入的验证，以评估其临床转化潜力。
